基于rDNA-ITS序列對(duì)黑枸杞內(nèi)生真菌分類(lèi)鑒定

楊小朵，藍(lán)秋菊，韋冠宇，鄭敬暉，劉俊林

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）屬于茄科（Solanceae）枸杞屬（LyciumL.），主要分布于我國(guó)青海、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古和西藏等地區(qū)。據(jù)記載，黑果枸杞果實(shí)具有強(qiáng)腎潤(rùn)肝、明目健胃的作用，也可用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)等，在民間多作為滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥物和降壓藥使用[1]。另外，黑枸杞的葉片和根被廣泛地加工為飲用泡茶。黑果枸杞果實(shí)中含有豐富的維生素，如維生素B1、維生素B2、維生素C，還富含F(xiàn)e、Zn、Se等無(wú)機(jī)元素，同時(shí)含有天然色素類(lèi)胡蘿卜素，其提取物也有較強(qiáng)的抗氧化作用[2]。

植物內(nèi)生真菌作為植物整體的一個(gè)重要組成部分，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物的積累以及對(duì)環(huán)境適應(yīng)等方面扮演著非常重要的角色[3]。內(nèi)生真菌（Endophyte）是指與健康植物共生，且不會(huì)引起宿主植物明顯病癥的一類(lèi)真菌。由于植物內(nèi)生菌與植物之間長(zhǎng)期的共生關(guān)系，使得這類(lèi)微生物具有對(duì)植物的促生長(zhǎng)和賦予植物抗逆性的作用，一些植物中的內(nèi)生菌還可以產(chǎn)生同植物宿主相同或者相似的活性物質(zhì)[4]。

核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）包括ITS1-5.8S-ITS2，不被轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，其進(jìn)化速率相對(duì)較快，適合種及種以下的分類(lèi)鑒定[5]。目前，有關(guān)黑枸杞的研究主要集中在活性成分提取、植物組織培養(yǎng)、生理機(jī)制等方面，而關(guān)于黑枸杞中內(nèi)生菌分類(lèi)的研究則少有報(bào)道。

本研究以藥用植物黑枸杞中已分離出來(lái)的10株內(nèi)生真菌為研究材料，利用PCR方法，擴(kuò)增rDNAITS序列，并應(yīng)用直接克隆測(cè)序及形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)這10株真菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，確定其種屬地位，為黑枸杞內(nèi)生真菌進(jìn)行系統(tǒng)分類(lèi)，為闡明黑枸杞中的真菌類(lèi)群提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為分離青海地區(qū)藥用植物黑枸杞中的活性天然產(chǎn)物提供寶貴的真菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑枸杞購(gòu)自青海省海西地區(qū)，經(jīng)西北民族大學(xué)劉俊林副教授鑒定為黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.），鑒定完成后立刻進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離及培養(yǎng)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、亞甲基藍(lán)（北京索萊寶科技有限公司）；Taq酶（日本東洋紡公司）。

HWS型智能恒溫恒濕箱（寧波東南儀器有限公司）；BME生物顯微鏡（上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；真菌全基因組提取試劑盒、引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）與ITS4（TCCGCTTATTGATATGC）（京索萊寶（Solarbio）科技有限公司）。

1.2 內(nèi)生真菌的分離純化

黑枸杞中內(nèi)生真菌的分離采用常規(guī)的組織塊分離法。分別選取健康植物材料的根、葉、莖和果實(shí)，于自來(lái)水下流水沖洗干凈，置無(wú)菌去離子水中漂洗，用已滅菌吸水紙吸干水分，截取1.0 cm左右的小段進(jìn)行表面消毒：（1）無(wú)菌條件下，于75%乙醇中滅菌30 s，無(wú)菌水沖洗2次；（2）3%次氯酸鈉溶液消毒3～5 min，無(wú)菌水漂洗3次。消毒完成后用無(wú)菌濾紙吸干水分，將消毒好的植物材料橫切成厚約1.0 mm的薄片，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，每皿9塊材料，15 ℃低溫暗培養(yǎng)，定期觀察。待組織塊邊緣有真菌菌絲生長(zhǎng)，即可轉(zhuǎn)皿純化，已純化的菌種在-80 ℃（10%甘油）條件下保藏[6]。

1.3 10株黑枸杞內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將10株內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。期間記錄其生長(zhǎng)速率并詳細(xì)描述其宏觀特征如菌落形狀、大小、顏色、氣味、質(zhì)地等。從PDA板上挑取生長(zhǎng)3～5 d的菌落邊緣菌絲，采用透明膠帶法制片，置于顯微鏡下觀察菌絲、孢子、孢子梗的形狀大小等顯微特征[7]。

1.4 10株內(nèi)生真菌基因組提取及序列擴(kuò)增

使用真菌基因組提取試劑盒提取10株內(nèi)生真菌DNA，使用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對(duì)rDNA的ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性 30 s，50.3 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 90 s并進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min；PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系，包括預(yù)混Taq酶10 μL、雙蒸水6.6μL、DNA 1.8 μL、Primer-F/R 各 0.8 μL[8]。PCR 產(chǎn)物純化后送交上海生物工程科技有限公司測(cè)序。

1.5 10株內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

對(duì)雙向測(cè)序得到的基因序列拼接并檢查，將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank。使用10株內(nèi)生真菌的ITS序列作為查詢(xún)序列，在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載與查詢(xún)序列相似的序列。得到13條ITS序列，所得序列用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。采用MAFFT網(wǎng)頁(yè)服務(wù)器（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）對(duì)同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)，使用MEGA7軟件手動(dòng)調(diào)整序列[9]。核苷酸替換模型使用MrModeltest 2.3進(jìn)行選擇[10]，采用raxmlGUI 1.5軟件[11]按照最大似然法（ML，Maximum likelihood），自展數(shù)（bootstrap）為 1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 10株內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

10株內(nèi)生真菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d后，有7株真菌的菌落直徑為1.6～2.0 cm，菌落質(zhì)地絨毛狀，菌絲白色，圖1（A和D），4～6 d菌絲變黃，菌落端生黃色分泌液滴，基底為棕黃色，菌絲光滑有隔；孢子光滑，呈橢圓狀。1株菌株在PAD培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7 d后，直徑 2.8～3.1 cm，如圖1（B 和 C），在PAD培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d時(shí)，菌落初均為白色，后產(chǎn)色素變紅，基地為黃紅色、絨氈狀，菌絲分枝、分隔；分生孢子倒梨形，單生或至多10個(gè)成短鏈狀，孢子囊球形；孢子梗菌絲狀，子囊孢子橢圓形，表面平滑。1株菌株的菌落為綠色，菌落質(zhì)地氈狀，基地顏色為黃綠色，產(chǎn)生分生孢子，表面光滑，見(jiàn)圖1。1株菌株菌落為青綠色，表面粗糙，有火山口的瘤狀突起，基地為綠色，分枝成帚狀的分生孢子，各頂端的小梗產(chǎn)生鏈狀的的分生孢子，見(jiàn)圖1（E）。通過(guò)與《真菌鑒定手冊(cè)》等資料[12-15]比對(duì)，可以基本確定10株內(nèi)生真菌的種屬，10株內(nèi)生真菌中的7株菌株鑒定為鬼傘屬（Coprinellus radians）；1株菌落鑒定為木霉屬（Trichoderma）；1株菌落鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineus）；1株鑒定為青霉菌屬（Penicillium）。然而，僅依據(jù)形態(tài)學(xué)特征很難準(zhǔn)確地鑒定物種的種屬。因此，可以采用序列分析的手段來(lái)獲得更多的遺傳信息并進(jìn)行進(jìn)一步的分類(lèi)。

圖1 黑枸杞中內(nèi)生真菌的菌落及孢子形態(tài)

2.2 10株黑枸杞內(nèi)生真菌的ITS序列分析

測(cè)序后得到1株內(nèi)生真菌的ITS序列長(zhǎng)度為1 540 bp，整理后提交 GenBank，獲得 ITS 序列號(hào)為MF372833。

如圖2所示，根據(jù)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出G-GEN-7（圖1B和1C）與Monascus sanguineus菌株處于同一分支，親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)98%；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后獲得的7株內(nèi)生真菌的ITS序列長(zhǎng)為454～465 bp，該序列的序列號(hào)為KT192203，同源性為98%，綜合ITS序列分析和形態(tài)學(xué)特征結(jié)果，將7株菌株鑒定為鬼傘屬（Coprinellus radians）；1株內(nèi)生真菌的ITS序列長(zhǎng)度為589 bp，該序列的序列號(hào)DQ339557，同源性79%，綜合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析結(jié)果，將此株菌株鑒定灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）；1株內(nèi)生真菌的ITS序列長(zhǎng)度為611 bp，該序列的序列號(hào)AF456922，同源性98%，綜合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析結(jié)果，將此株菌株鑒定為綠色木霉（Trichoderma viride）。ITS區(qū)進(jìn)化速度較快，在真菌的種間存在著明顯豐富的變異，但在種內(nèi)不同菌株間卻高度保守，可以用其鑒定到種及以下水平。

圖2 基于rDNA-ITS基因序列的10株內(nèi)生真菌的進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論

本研究對(duì)從青海海西購(gòu)買(mǎi)的黑枸杞中純化分離的10株內(nèi)生真菌進(jìn)行了綜合形態(tài)學(xué)觀察和序列分析，將其中的7株菌株鑒定為鬼傘屬（Cop rinellus radians），1株菌落鑒定為綠色木霉（Trichodermaviride），1株菌落鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineus），1株鑒定為灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）。獲得的10株內(nèi)生真菌菌株的鑒定拓寬了植物內(nèi)生真菌的來(lái)源，同時(shí)為研究黑枸杞及10株內(nèi)生真菌菌株的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。