Y2O3:Yb,Er納米粒子的制備及生物學表征

汪沁，齊嘉欣，溫金熙，周興平

（東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

近年來，上轉換熒光材料由于具有新穎的光學和化學性質，其合成研究引起了廣泛的關注[1-2]。氧化釔（Y2O3）是一種很有前途的上轉換材基質，其在摻入Yb3+和Er3+離子后，可以表現(xiàn)出很強的熒光性質。制備這種材料的方法多種多樣，包括溶膠-凝膠法[3]、固相法[4]、共沉淀法[5]、水熱法[6]和燃燒法[7]。一般情況下，使用水熱法進行制備，再煅燒生成產物。但是，Y2O3納米材料還存在一些有待解決的問題，如制備時所需的煅燒溫度較高[8]、由氫氧化物制備氧化物的情況居多[9-10]、會使反應物有殘留、產物不純以及光穩(wěn)定性不佳等，使其在實際應用中受限很大。此外，納米材料有很多傳統(tǒng)的微米尺寸熒光材料沒有的優(yōu)勢，這些性質大多數(shù)與顆粒的大小等性質密切相關。通過改變某些反應條件，會對化合物的各種性質產生影響。因此，有必要對納米發(fā)光材料的制備過程進行優(yōu)化，以得到各種應用中所需要的不同性質的納米粒子。

目前，Y2O3已經應用于很多領域，例如陶瓷[11]、半導體[12]、催化劑[13]和生物探針[14]等。已有研究表明Y2O3上轉換發(fā)光材料可以用于骨修復材料[15]，且Y2O3:Yb，Er納米粒子有優(yōu)異的光學性質和穩(wěn)定性，說明Y2O3:Yb，Er在生物學有潛在的應用價值。而細胞和Y2O3:Yb,Er納米粒子之間的生物相容性是納米粒子應用于生物學的重要參數(shù)。因此，研究其生物學性質具有很深遠意義。

本文以硝酸釔和尿素為主要原料，用水熱-煅燒兩步法對制備Y2O3:Yb,Er納米粒子的條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子，并對其進行了生物學性質探究，為其在生物學領域的應用提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

尿素（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；硝酸釔（AR，阿拉丁試劑有限公司）；硝酸鐿（AR，西格瑪奧德里奇貿易有限公司）；硝酸鉺、十六烷基三甲基溴化銨（AR，阿達瑪斯試劑有限公司）；無水乙醇（AR，常熟市楊園化工有限公司）。

Nano-ZS納米粒度與電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；Avatar380紅外光譜儀，美國熱電集團；D/max-2550PC X射線粉晶衍射光譜儀，日本Rigaku；FLS-1000熒光光譜儀，天美科學儀器有限公司；JSM-5600LV場發(fā)射掃描電鏡，日本JEOL；酶標儀，Multiskan Sky；SP8 共聚焦熒光顯微鏡，德國 Leica。

1.2 實驗方法

1.2.1 Y2O3:Yb,Er納米粒子的制備

室溫下，將 0.319 2 g 硝酸釔、0.086 2 g 硝酸鐿和0.006 9 g硝酸鉺溶于30 mL去離子水中，再將0.182 2 g十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和1.201 2 g尿素加入去離子水中繼續(xù)溶解。然后將此溶液倒入反應釜中，水熱法在160 ℃下反應3 h；冷卻后取出，用去離子水和乙醇反復洗滌，然后離心、干燥。最后將所得產物在600 ℃下煅燒2 h后得到Y2O3:Yb,Er粉末。

改變水熱法反應物溫度（130～200 ℃，10 ℃一個梯度），得到不同溫度條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子。

用吐溫80取代CTAB作為表面活性劑，或不添加表面活性劑，制備Y2O3:Yb,Er納米粒子。

改變煅燒溫度（200～800 ℃，100 ℃一個梯度），得到不同煅燒溫度條件下的Y2O3:Yb,Er納米粒子。

1.2.2 細胞毒性實驗

實驗選用Y2O3:Yb,Er納米粒子為試樣，Hela細胞為受體。將HeLa細胞以每孔5 000個細胞的密度接種在1640培養(yǎng)基（RPMI-1640,含10%FBS）的96孔板中，并生長24 h。添加新鮮培養(yǎng)基中濃度為0.7～200 μg/mL的Y2O3:Yb,Er納米粒子作為替代品，并將細胞孵育24 h。然后除去工作溶液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞兩次。將總計10 μL的CCK-8（Cell Counting Kit-8，BIOMIKY）添加到每個孔中，并將細胞在5%的CO2濕潤的氣氛中于37 ℃進一步孵育 1 h。將板搖動 5 min，并使用酶標儀在 450 nm處測量吸光度。

1.2.3 細胞成像實驗

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用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在玻底皿中接種30 000個Hela細胞。將玻底皿置于培養(yǎng)箱中在37 ℃、5% CO2的 條 件 下 培 育 24 h。Hela細 胞 首 先 用Y2O3:Yb,Er納米顆粒（事先用聚乙二醇修飾）在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中染色12 h。用PBS洗皿兩次，然后用4%的多聚甲醛固定20 min，細胞核染料4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，0.08 μg/mL）隨后孵化 30 min。最終用盛著PBS的玻底皿在激光共聚焦熒光顯微鏡下進行成像。

2 結果與討論

2.1 Y2O3:Yb,Er制備條件的優(yōu)化

2.1.1 反應溫度對Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

圖1為不同反應溫度下制備的Y2O3:Yb, Er納米粒子與標準卡片的XRD對比圖。從圖中可以看出，不同溫度下制得的Y2O3:Yb, Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，證實了Y2O3:Yb, Er納米粒子的形成。

圖1 不同反應溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子XRD圖及與標準卡片的對比

圖2為不同反應溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光譜圖。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在130～160 ℃范圍內，隨著反應溫度的升高，Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強度呈現(xiàn)增強的趨勢，160 ℃時，Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強度最強，隨著溫度繼續(xù)升高，Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強度呈現(xiàn)減弱的趨勢。這可能是因為Y2O3形成之前為帶結晶水的碳酸釔[16]，一般情況下，溫度超過200 ℃后，結晶水就已經完全消失[17]。說明在超過一定溫度時，會破壞前驅體的結構，致使煅燒后產生不利影響，導致熒光強度的降低。

圖2 不同反應溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子熒光圖及最大熒光強度變化趨勢圖

2.1.2 不同表面活性劑對Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

圖3為不同表面活性劑下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的與標準卡片的XRD對比圖。從圖中可以看出，不同表面活性劑下制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，證實了Y2O3:Yb,Er納米粒子的形成。

圖3 不同表面活性劑下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的XRD圖及與標準卡片的對比

圖4為不同表面活性劑下Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光圖譜。從圖中可以看出，發(fā)射峰基本在同一個位置，沒有變化，發(fā)光最強的為以CTAB為表面活性劑制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子，以吐溫80為表面活性劑時發(fā)光強度次之，當無表面活性劑時，發(fā)光最弱。因為氧化釔為無機晶體，吐溫80作為非離子表面活性劑，游離在溶液中，難以與溶液中離子相結合，起到促進反應進行的作用。而CTAB為陽離子表面活性劑，可以與溶液中的陰離子結合，使表面活性劑中的氨基帶上正電荷，促進反應進行。同時，加入表面活性劑之后，產物的分散性變好，缺陷較少，導致熒光強度變強。

圖4 不同表面活性劑條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子熒光圖譜及SEM圖：（a）無表面活性劑；（b）吐溫80；（c）CTAB

圖4中SEM圖通過Nanometer軟件計算得出，未加入表面活性劑時，產物的粒徑為41.0 nm；加入吐溫80時，產物的粒徑為44.7 nm；加入CTAB時，產物的粒徑為46.8 nm。加入表面活性劑之后，產物的粒徑變大。聯(lián)系其發(fā)光性能，可以看出，大的顆粒，晶體的完整性好，發(fā)光能力更強；從無表面活性劑到非離子型表面活性劑再到陽離子型表面活性劑，所形成的顆粒變大，可能與其在正生長的粒子表面的吸附能力差異有關[18]。

2.1.3 不同煅燒溫度對Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

圖5為不同煅燒溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子與標準卡片的XRD對比圖。從圖中可以看出，不同煅燒溫度下制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，證實了Y2O3:Yb,Er納米粒子的形成。

圖5 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子XRD圖及與標準卡片的對比

因為在500 ℃之前沒有形成Y2O3，沒有表現(xiàn)出發(fā)光性能，所以只能研究在500～800 ℃不同煅燒溫度下熒光強度的變化。從圖6中可以看出，樣品隨著溫度的升高在600 ℃時表現(xiàn)出最佳的發(fā)光強度，然后隨著溫度的繼續(xù)升高，熒光強度降低?？赡苁且驗殡S著樣品的結晶度降低和缺陷的存在，導致發(fā)光性能降低。

圖6 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光譜圖

對不同煅燒溫度下（200～800 ℃）的產物進行紅外測試分析（圖7），產物經500 ℃煅燒2 h后，在1 635 cm-1處 C=O[19]的吸收峰大大減弱。200～800 ℃煅燒后樣品的紅外光譜的峰位置沒有太大變化，強度有所不同。這可能是因為晶粒大小的變化在紅外光譜上體現(xiàn)的不太明顯[20]，而表示碳酸的1 522 cm-1處的特征峰[21]和表示C-O的1 365 cm-1處的特征峰[22]的吸收強度先是隨著煅燒溫度的升高而逐漸減弱，到600 ℃以后，吸收峰的強度基本保持不變。這表明，碳酸的量先是隨溫度升高而減少，600 ℃后基本不變，并且吸收強度弱到幾乎沒有，而在562 cm-1處的峰，歸屬于Y2O3中Y-O[23]的特征峰，說明煅燒至600 ℃時前驅體已經完全轉變?yōu)閅2O3，表明已經生成了Y2O3。

圖7 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子紅外光譜

圖8為煅燒前后Y2O3:Yb,Er納米粒子的掃描電鏡圖（SEM），粒徑測試結果為煅燒前平均粒徑50.5 nm，煅燒后平均粒徑32.85 nm，煅燒后粒子大小比前驅體小，且煅燒前后納米粒子的形態(tài)良好。說明煅燒后Y2O3:Yb,Er納米粒子也能保持一個良好的形態(tài)。

圖8 煅燒前（a）和煅燒后（b）Y2O3:Yb,Er納米粒子的SEM圖以及粒徑圖

2.2 Y2O3:Yb,Er納米粒子的生物學表征

2.2.1 Y2O3:Yb,Er的細胞毒性實驗

圖9為細胞孵育24 h后的細胞活性圖，很直觀地揭示了Y2O3:Yb，Er納米粒子的細胞毒性。分析對照組和空白組可知，當Y2O3:Yb,Er的濃度高于200 mg/mL時，細胞存活率依然大于85%。與傳統(tǒng)的熒光標記物如有機染料、半導體量子點相比，Y2O3:Yb,Er納米粒子的毒性很小，體現(xiàn)出良好的生物相容性，說明Y2O3:Yb,Er對細胞的損傷較小。

圖9 不同濃度Y2O3:Yb,Er對細胞存活率的影響

2.2.2 Y2O3:Yb,Er的細胞成像實驗

圖10（a）是DAPI染色的細胞核，圖10（b）是Y2O3:Yb,Er納米粒子在 980 nm 激發(fā)下，500～800 nm范圍內的熒光圖像，圖10（d）是將圖10（a）和圖10（b）結合在一起的圖片，從圖10（d）中可以看出Y2O3:Yb,Er納米粒子已經被細胞吞噬，并包裹在細胞核周圍，說明Y2O3:Yb,Er納米粒子有良好的的生物相容性，可以應用于生物學領域。

圖10 Y2O3:Yb,Er的細胞成像圖：（a）DAPI，0.08 mg/mL；（b）Y2O3:Yb,Er熒光偽彩圖像（500～800 nm），980 nm激發(fā)；（c）明場圖片：（d）a和b的合并圖像

3 結論

用水熱-煅燒兩步法制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子平均粒徑為32.85 nm。Y2O3:Yb,Er納米粒子在600 ℃煅燒下?lián)碛辛己玫木秃桶l(fā)光強度，比一般文獻中報道的煅燒溫度都低。此外，Y2O3:Yb,Er納米粒子幾乎沒有細胞毒性，并且具有很好的生物相容性，這對Y2O3:Yb,Er納米粒子在生物學領域的應用提供了一定的價值。