豬鏈球菌2型制苗用菌株的篩選

陳 章，吳華健，毛天驕，韓業(yè)芹，孫 裴，魏建忠，李東風(fēng)，李 郁，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2.安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥 230001)

豬鏈球菌病是鏈球菌屬中豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)、馬鏈球菌類馬亞種(Streptococcusequisubsp equi)、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp. Zooepidemicus)和蘭氏(Lancefield)分群中D、E、L群鏈球菌引致豬疫病的總稱[1]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和急性出血性敗血癥[2]。SS是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病的最主要的病原，根據(jù)SS莢膜抗原的差異性可分為35個血清型(1/2型和1～34型)，其中以2型豬鏈球菌(SS2)對豬的致病力最強，流行范圍最廣[3]。臨床上SS2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、支氣管炎波氏桿菌和副豬嗜血桿菌混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致豬群發(fā)病率和死亡率都明顯上升[4-5]。

近些年來我國豬場豬鏈球菌病發(fā)病頻繁，不僅給公共衛(wèi)生安全帶來威脅，同時也給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[6-7]。目前，防控豬鏈球菌病的主要措施是疫苗免疫接種和抗菌藥物防治。然而，抗生素的亂用、濫用等不合理使用導(dǎo)致耐藥菌不斷產(chǎn)生，且多重耐藥譜逐年增加，因此疫苗免疫接種成為防控豬鏈球菌病的有效辦法[8]。由于SS血清型種類眾多，各型SS致病力和生物學(xué)特性存在差異，且相互之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)力[9]，故在生產(chǎn)中常出現(xiàn)免疫失敗或免疫不確實的情況。本研究從6株臨床分離的SS2強毒株中，基于致病力、抗原性和穩(wěn)定性試驗，最終綜合篩選確定SS2制苗用菌株，從而為研制具有更佳免疫保護(hù)性的滅活疫苗及其多聯(lián)、多價疫苗提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

受試菌株是由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室自臨床病例分離鑒定的43株SS2，經(jīng)毒力因子溶血素(suilysin，SLY)、溶菌酶釋放蛋白(muraminidase released protein，MRP)、胞外蛋白因子(extracellular protein factor，EF)、莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)檢測，對昆明鼠、斑馬魚的致病力試驗和溶血性(綿羊血、兔血)測定，初步篩選6株SS2強毒株，分別編號為BB1、BZ1、XC1、HF1、HF2、HF3[10]。

攻毒菌株源自臨床急性敗血型病豬，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室分離、鑒定和保存，對斑馬魚的LD50為0.62×102CFU·mL-1(SS2標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43765對斑馬魚的LD50為3.14×104CFU·mL-1)，編號AH10-8并確定為攻毒菌株[10]。

1.2 主要試劑

三卡因購自濟南嘉格生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗體均購自Sigma公司；小牛血清購自南京寶靈科生物技術(shù)有限公司；0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)均購自紹興天恒生物科技有限公司。

1.3 試驗動物

試驗用80日齡的AB系斑馬魚(體長約3.6 cm)購自合肥裕豐花鳥市場御龍水族館，參考Rowe等[11]方法進(jìn)行飼養(yǎng)；3～4月齡新西蘭大白兔、SPF級雌性昆明鼠(體質(zhì)量18～22 g)均購自安徽醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心。

1.4 抗原和血清制備

1.4.1 SS2抗原

重組溶血素蛋白(SLY)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室提供，經(jīng)免疫攻毒保護(hù)試驗和Western blotting鑒定其具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性[12]，分子量為60 ku，-80 ℃保存?zhèn)溆?。AH10-8株全菌體超聲破碎裂解物制備：在100 mL TSB-YE中接種AH10-8攻毒菌株，150 r·min-137 ℃培養(yǎng)14 h，利用超聲破碎充分釋放菌體抗原[12]，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血清

SS2陰性鼠(兔)血清：采集健康鼠(兔)未免疫接種SS2陰性血清，-20 ℃保存。SS2陽性鼠(兔)血清：在TSB-YE中接種SS2受試菌株，150 r·min-137 ℃培養(yǎng)14 h，以0.3%體積比加入甲醛滅活，與氫氧化鋁膠均勻混合，對昆明鼠進(jìn)行腹腔接種(每只0.5 mL)，對家兔進(jìn)行肌肉接種(每只5 mL)，一免14 d后進(jìn)行第二次免疫，2次免疫的途徑及劑量均相同。二免后7 d，昆明鼠眼球靜脈采血[13]，家兔心臟采血[14]，收集SS2陽性血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 致病力試驗

用遞加法測定6株受試菌株的最大非致死量(LD0)和絕對致死劑量(LD100)。在LD0和LD100區(qū)間范圍內(nèi)，設(shè)置5個劑量組，相鄰組間劑量參考文獻(xiàn)[13]，每株受試菌株設(shè)置5個組，采用寇氏改良法計算受試菌株的LD50。昆明鼠攻毒試驗中，每組小鼠10只，試驗組每只小鼠注射0.3 mL受試菌液，空白對照組小鼠注射等體積生理鹽水，統(tǒng)計一周內(nèi)小鼠死亡情況并對受試菌株進(jìn)行回收鑒定。斑馬魚攻毒試驗中，每組斑馬魚15尾，攻毒組每尾斑馬魚注射10 μL受試菌液，空白對照組斑馬魚注射等體積生理鹽水，統(tǒng)計72 h內(nèi)斑馬魚死亡情況并對受試菌株進(jìn)行回收鑒定。數(shù)據(jù)采用q檢驗(95%置信水平)，計算各組q值，根據(jù)q界值表取舍極端值[9]。

1.6 滅活全菌體制備

在50 mL的TSB-YE中，按體積比1∶100將6株受試菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)接并增菌14 h，以濃縮或稀釋的方式使活菌數(shù)均達(dá)到2.0×109CFU·mL-1，按照0.3%的體積比加入甲醛滅活，之后利用無菌PBS對滅活菌體清洗4次。在TSB-YE中接種200 μL滅活菌液，180 r·min-137 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌液是否渾濁，若菌液未變渾濁，于TSA-YE上涂布200 μL菌液，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察TSA-YE上是否有細(xì)菌生長。若無細(xì)菌生長，按氫氧化鋁膠∶菌液體積比1∶9將氫氧化鋁膠加入滅活成功的菌液中，待攪拌均勻，置4 ℃保存。

1.7 抗原性試驗

1.7.1 昆明鼠、新西蘭大白兔血清IgG抗體檢測

分別用包被液將AH10-8株全菌體超聲裂解物和純化的重組SLY稀釋成10 μg·mL-1，包被酶標(biāo)板4 ℃過夜，洗板3次后，50 g·L-1的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，再次洗板3次后，血清從1∶25稀釋至1∶819 200，同時設(shè)置陰性對照和2個重復(fù)孔，37 ℃作用1 h。洗板3次后，分別加入稀釋的羊抗鼠HRP-IgG(1∶3 000)和羊抗兔HRP-IgG(1∶50 000)，37 ℃作用1 h。洗板3次后加入TMB顯色液，37 ℃避光靜置10 min，加入H2SO4終止液，輕微震蕩后置于全波長多功能酶標(biāo)儀中測定D490。根據(jù)待測血清D490(P)/陰性血清D490(N)≥2.1的界限判定為陽性，并測定其抗體效價。

1.7.2 斑馬魚免疫攻毒試驗

將120尾斑馬魚隨機分成8組，每組15尾。試驗組分別為BB1、BZ1、XC1、HF3、HF2、HF1滅活全菌體，每組每尾斑馬魚免疫10 μL滅活菌液(2×109CFU·mL-1)，空白對照組和攻毒對照組免疫等量PBS。一免14 d后進(jìn)行加強免疫，免疫佐劑為氫氧化鋁膠佐劑。二免7 d后，使用AH10-8株對試驗組和攻毒對照組進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為50 LD50，空白對照組注射等量PBS，均采用腹腔注射方式攻毒。統(tǒng)計斑馬魚的死亡情況，并計算免疫保護(hù)率。

1.7.3 昆明鼠免疫攻毒試驗

將40只昆明鼠隨機分成8組，每組5只。試驗組分別為BB1、BZ1、XC1、HF3、HF2、HF1滅活全菌體，每組每只昆明鼠免疫滅活菌液0.5 mL(2×109CFU·mL-1)，空白對照組和攻毒對照組免疫等量PBS。一免14 d后進(jìn)行加強免疫，免疫途徑均為腹部皮下多點注射，免疫佐劑均為氫氧化鋁膠佐劑。二免7 d后，使用AH10-8株對試驗組和攻毒對照組進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為50 LD50，空白對照組注射等量PBS，均采用腹腔注射方式攻毒。統(tǒng)計昆明鼠的死亡情況，并計算免疫保護(hù)率。

1.8 穩(wěn)定性試驗

在TSA-YE上接種所篩選受試菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)出單個菌落后進(jìn)行轉(zhuǎn)種為1次傳代，連續(xù)作30次傳代。測定第10代、20代、30代受試菌株對斑馬魚和昆明鼠的LD50。制備所篩選受試菌株的第10代、20代、30代滅活全菌體，采集鼠抗SS2陽性血清和陰性血清完成ELISA抗體效價測定。利用所篩選受試菌株的第10代、20代、30代滅活全菌體，測定其對斑馬魚和昆明鼠的免疫保護(hù)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病力試驗結(jié)果

BB1、BZ1、XC1、HF1、HF2、HF3對斑馬魚和昆明鼠的LD50(表1)，其中受試菌株BZ1、HF2、HF3對斑馬魚和昆明鼠的LD50均低于HF1、XC1、BB1。

2.2 抗原性試驗結(jié)果

2.2.1 昆明鼠和兔血清IgG抗體檢測結(jié)果

如表2所示，以重組SLY作為包被抗原時，二免昆明鼠血清中BZ1的IgG抗體效價(1∶3 200)最高，二免兔血清中BZ1和HF3的IgG抗體效價(均為1∶6 400)最高。以AH10-8株全菌體超聲裂解物作為包被抗原時，二免昆明鼠血清中BZ1和HF2的IgG抗體效價(均為1∶25 600)最高，二免兔血清中BB1和HF2的IgG抗體效價(均為1∶204 800)最高。

2.2.2 斑馬魚和昆明鼠免疫攻毒試驗結(jié)果

如表3所示，斑馬魚免疫保護(hù)率測定結(jié)果顯示，滅活全菌體HF3和HF2分別為86.7%和80%，BZ1、XC1、BB1分別為66.7%、60%和60%，而HF1為40%；昆明鼠免疫保護(hù)率測定結(jié)果顯示，滅活全菌體HF2和BZ1均為100%，BB1、HF1、HF3均為60%，而XC1為40%。

表1 受試菌株對斑馬魚和昆明鼠的致死作用Table 1 Lethal effect of tested strains in zebrafish and Kunming mice

表2 受試菌株免疫昆明鼠和兔血清IgG抗體檢測結(jié)果Table 2 Determination of serum IgG antibody in Kunming mice and rabbit immunized with tested strains

表3 受試菌株滅活全菌體對斑馬魚和昆明鼠的免疫攻毒試驗結(jié)果Table 3 Determination of immune challenge test of tested strains inactivated whole bacteria to zebrafish and Kunming mice

2.3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

如表4所示，BZ1傳至第10代、20代和30代時，斑馬魚和昆明鼠的LD50均處于上升趨勢；HF3在10代內(nèi)對斑馬魚和昆明鼠的LD50分別為9.77×104CFU·mL-1、2.19 ×109CFU·mL-1，傳至第30代均趨于穩(wěn)定；HF2在10代內(nèi)對斑馬魚和昆明鼠的LD50分別為7.76×103CFU·mL-1、1.07 ×109CFU·mL-1，傳至第30代均趨于穩(wěn)定。

如表5所示，30代內(nèi)制備的BZ1、HF3和HF2滅活全菌體免疫接種昆明鼠均可誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性抗體，其中BZ1的血清抗體效價由第10代的1∶12 800下降至第30代的1∶6 400；HF3和HF2的血清抗體效價均由第10代的1∶51 200下降至第30代的1∶12 800。

如圖1所示，HF2和HF3在第10～30代對斑馬魚的免疫保護(hù)率分別為66.7%～60%和80%～60%，始終高于BZ1，BZ1在第30代對斑馬魚的免疫保護(hù)率降至53.3%。HF2和HF3在第10～30代對昆明鼠的免疫保護(hù)率分別為100%～80%和80%～60%，始終高于BZ1，BZ1在第30代對昆明鼠的免疫保護(hù)率降至40%。

3 討論

自上世紀(jì)50年代起，對豬鏈球菌病的研究就從未間斷。在宿主對抗豬鏈球菌感染過程中，細(xì)胞免疫和體液免疫發(fā)揮重要作用[14]，其中疫苗免疫接種作為防控豬鏈球菌病的有效措施，目前主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗。弱毒疫苗誘導(dǎo)的抗體持續(xù)時間長、產(chǎn)生速度快，但存在毒力返強的風(fēng)險，且易受抗生素和母源抗體的干擾；滅活疫苗相對穩(wěn)定，可用于制備多聯(lián)疫苗，且不易受母源抗體干擾[15]，但存在抗體維持時間短、抗原性低等缺陷。制苗用菌株的特性與細(xì)菌滅活疫苗的免疫效果密切相關(guān)，即在菌株信息完備和生物學(xué)特性典型的基礎(chǔ)上，不僅需要菌株的致病力強、抗原性好，同時在傳代過程中表現(xiàn)出遺傳性狀的相對穩(wěn)定[16]，因此需要通過致病力、抗原性和穩(wěn)定性試驗綜合確定細(xì)菌滅活疫苗用菌株。

表4 第10、20、30代BZ1、HF3、HF2對斑馬魚和昆明鼠的LD50Table 4 10th， 20th， 30th generations of the BZ1、HF3、HF2 on LD50 of zebrafish and Kunming mice

表5 第10、20、30代滅活全菌體免疫昆明鼠血清IgG檢測結(jié)果Table 5 Determination of serum IgG antibody in Kunming mice immunized with 10th， 20th， 30th generations of inactivated whole bacteria

A, 斑馬魚； B, 昆明鼠。A, zebrafish; B, Kunming mice.圖1 HF2、HF3、BZ1對斑馬魚和昆明小鼠的免疫保護(hù)率Fig.1 Immune protection rate of HF2， HF3， BZ1 on zebrafish and Kunming mice

衡量病原微生物致病力或毒力強弱的重要指標(biāo)之一是半數(shù)致死量(LD50)[17]。本試驗由43株SS2臨床分離株，通過斑馬魚和昆明鼠致病力試驗篩選出6株受試菌株，其中BZ1、HF2、HF3的LD50在2種試驗動物上皆低于BB1、XC1、HF1，顯示出更強的致病力。本研究中6株受試菌株對斑馬魚的LD50均低于昆明鼠，表明斑馬魚較昆明鼠更適合作為動物模型研究SS2，與Zaccaria等[18]關(guān)于斑馬魚可以評估SS2菌株毒力的報道相一致。

抗原性是制苗用菌株的重要指標(biāo)，其中免疫原性是指機體被免疫抗原刺激產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的特性，常通過動物免疫攻毒試驗計算免疫保護(hù)率來表示，而反應(yīng)原性是指抗原與相應(yīng)的效應(yīng)性淋巴細(xì)胞或抗體發(fā)生特異性結(jié)合的特性，常利用體外血清學(xué)方法測定抗體效價來表示[19]。本研究中，免疫滅活全菌體BB1、BZ1、HF2和HF3產(chǎn)生的IgG抗體效價優(yōu)于XC1和HF1，表現(xiàn)出較好的反應(yīng)原性，其中滅活全菌體BZ1、HF2、HF3對斑馬魚和昆明鼠的免疫保護(hù)率均最高。ELISA檢測抗體水平的特異性和靈敏度受到包被抗原質(zhì)量的決定性影響[20]。本研究分別以重組SLY和AH10-8株全菌體超聲裂解物作為包被抗原測定抗體效價，結(jié)果顯示后者的抗體效價值更高，可能原因是全菌體超聲裂解物相較于重組SLY包含的抗原種類更多，刺激機體產(chǎn)生的IgG更加全面，作為包被抗原的結(jié)合反應(yīng)特異性和靈敏度均優(yōu)于單一重組SLY。根據(jù)致病力和抗原性測定結(jié)果，最終篩選出BZ1、HF2和HF3等3株受試菌株進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。

穩(wěn)定的遺傳性狀是制苗用菌株安全、有效和高產(chǎn)的重要保證，主要包括抗原性和致病力等方面[21]。本研究中，BZ1、HF2、HF3從0代傳至第10代對斑馬魚及昆明鼠的致病力均有所減弱，其中BZ1傳至第20、30代時仍呈現(xiàn)下降趨勢，而HF2、HF3則趨于穩(wěn)定。由于SS2的體外培養(yǎng)環(huán)境相較體內(nèi)存在較大差異，某些毒力因子的表達(dá)受特定的體內(nèi)條件限制，連續(xù)的體外傳代可能抑制了某些毒力因子的表達(dá)，導(dǎo)致其毒力減弱[22]，其中HF2、HF3相較于BZ1在傳至10代后適應(yīng)了培養(yǎng)基環(huán)境，毒力逐漸趨于平穩(wěn)。同時HPS毒力與抗原性呈正相關(guān)[23]，表明HF2、HF3的抗原穩(wěn)定性優(yōu)于BZ1，能夠為昆明鼠提供更好的免疫保護(hù)。滅活全菌體HF2、HF3的血清抗體效價和免疫保護(hù)率均高于同代的BZ1，具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性，其中在10代之內(nèi)，HF2、HF3抗原性穩(wěn)定，之后與BZ1均開始下降。分析原因，一方面是SS2的免疫原性易受人工培養(yǎng)基中pH值和營養(yǎng)成分的影響，造成疫苗菌株免疫效力的降低[24]；另一方面，SS2在體外連續(xù)傳代過程中部分組分發(fā)生改變以及菌體損傷的出現(xiàn)，致使誘導(dǎo)機體產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的能力減弱[24]。綜合分析顯示，HF2和HF3不僅擁有較強的致病力和抗原性，同時在穩(wěn)定性試驗中能夠維持優(yōu)良的遺傳性狀，適合作為SS2制苗用菌株。

本研究選用6株臨床分離的SS2強菌株，基于制苗用菌種的鑒定要求和選擇標(biāo)準(zhǔn)，通過致病力、抗原性以及穩(wěn)定性試驗綜合篩選出HF2和HF3作為SS2制苗用菌株，從而為研制具有更佳免疫保護(hù)性的滅活疫苗及其多聯(lián)、多價疫苗提供技術(shù)支撐。