胡桃苷對非酒精性脂肪性肝小鼠中肝脂質(zhì)代謝紊亂、肝損傷以及小腸完整性的改善作用

虞玲燕, 臺州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))浙江省臺州醫(yī)院急救中心 浙江省臺州市 317000

李衛(wèi)英, 臺州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))浙江省臺州醫(yī)院注射科 浙江省臺州市 317000

林佳, 嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院 浙江省嘉興市 314001

0 引言

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是以肝細(xì)胞中異常的脂質(zhì)積累和脂肪變性為特征并伴隨肝損傷的慢性代謝異常性肝病[1]. 該類疾病若治療不當(dāng)或重視度不足, 會最終進(jìn)展為肝纖維化或肝癌[2]. 據(jù)報道[3], 全球約有30%成年人口罹患NAFLD, 因此, NAFLD己成為一種全球性質(zhì)的嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病. 而目前現(xiàn)有的NAFLD治療措施的效果并不十分的理想.

NAFLD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜, 主要包括胰島素抵抗(insulin resistance, IR)引發(fā)的肝脂代謝紊亂并進(jìn)一步觸發(fā)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激, 最終引起肝細(xì)胞的脂質(zhì)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞損傷和凋亡[4]. 細(xì)胞炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6, IL-6)等可通過抑制胰島素信號傳導(dǎo)和肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制, 在IR和肝細(xì)胞炎癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[5]. 并且, 研究[6]發(fā)現(xiàn), 核受體家族的一些成員不僅是肝臟脂肪生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 而且也是肝臟和全身炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 特別是過氧化物酶體增殖體激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR-α), 其主要表達(dá)于肝臟, 通過控制脂質(zhì)合成基因的表達(dá)參與體內(nèi)脂質(zhì)循環(huán)和細(xì)胞脂質(zhì)的代謝. 因此, 它與脂肪變性的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān), 目前它是該疾病的治療靶點. 近年來, 胡桃苷作為從胡桃楸的綠色果殼、胡桃葉、茴香莖葉和透骨草中提取的天然化合物, 對炎癥反應(yīng)和腫瘤生長有抑制作用[7]. Zhou等[8]在果糖誘導(dǎo)的肝炎大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn), 胡桃苷可抑制果糖誘導(dǎo)的肝損傷和肝炎. 由以上背景推測, 胡桃苷可能會對NAFLD產(chǎn)生一定的治療作用. 然而, 目前關(guān)于胡桃苷對NAFLD中作用的研究尚未見報道. 因此, 本實驗采用高脂飲食(high fat diet, HFD)的實驗?zāi)Ｐ蛠碚T導(dǎo)小鼠NAFLD, 觀察胡桃苷對HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性和肝損傷、炎癥和脂質(zhì)代謝紊亂以及小腸通透性受損的影響,并分析其中的機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物: 30只8周齡SPF級C57BL/6小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001], 飼養(yǎng)于臺州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))動物實驗中心SPF級動物房[SYXK(浙)2014-0020], 飼養(yǎng)環(huán)境為模擬晝夜12 h/12 h交替、室溫22-25 ℃、50%-60%濕度, 小鼠可自由飲水.

1.1.2 實驗試劑: 胡桃苷購于上海酶聯(lián)生物公司; 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染液試劑盒、油紅O染液、小鼠胰島素(insulin) ELISA試劑盒和FITC-Dextran購于上海雅吉生物公司; 小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT) ELISA試劑盒和小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST) ELISA試劑盒購于南京建成生物公司; 膽固醇(cholesterol, CHOL)試劑盒購于美國Biovision公司; TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司;Prime Script RT Master Mix試劑盒購于大連TaKaRa公司;乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase, ACC)、磷酸化ACC(phospho-ACC, p-ACC)、IL-6、IL-1β、TNF-α和β-Actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;緊密連接蛋白1(tight junction protein zonula occludens-1,ZO-1)抗體購自美國Abcame公司.

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組與處理: 30只C57BL/6小鼠, 隨機(jī)分成標(biāo)準(zhǔn)飲食組(standard diet, STD)、高脂飲食組(high fat diet, HFD)、胡桃苷低劑量治療組(HFD+Low dose,HFD+L)、胡桃苷中劑量治療組(HFD+Middle dose,HFD+M)、胡桃苷高劑量治療組(HFD+High dose,HFD+H), 每組6只小鼠. STD飼料含有15%脂肪、22%蛋白質(zhì)和63%碳水化合物, 而HFD飼料含有58%脂肪、18%蛋白質(zhì)和24%碳水化合物. STD組采用STD飼料連續(xù)喂養(yǎng)8 wk; HFD組采用HFD飼料連續(xù)喂養(yǎng)8 wk; 胡桃苷低、中、高劑量治療組采用HFD飼料連續(xù)喂養(yǎng)8 wk,并在第5周末分別給予5、10和20 mg/kg·d胡桃苷灌胃,連續(xù)3 wk.

1.2.2 血液生化檢測: 小鼠在給藥方案結(jié)束后, 禁食禁水12 h, 并通過腹腔注射氯胺酮麻醉小鼠, 摘取眼球采血, 取血清. 血清ALT、AST、CHOL、空腹血糖和空腹insulin根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測. 并通過穩(wěn)態(tài)模式評估公式: (homeostasis assessment of insulin resistance,HOMA-IR) = [空腹血糖(mmol/L)×空腹insulin (μU/mL)]/22.5計算IR程度.

1.2.3 FITC-Dextran檢測腸道通透性: 小鼠在給藥方案結(jié)束后, 禁食禁水12 h, 并通過腹腔注射氯胺酮麻醉小鼠, 經(jīng)口灌胃0.5 g/kg FITC-Dextran后, 4 h后, 通過門靜脈取血, 用熒光酶標(biāo)儀測量門靜脈血中490 nm激發(fā)波長和520 nm發(fā)射波長下熒光值來評估腸道通透性變化.

1.2.4 組織收集: 給藥結(jié)束后, 通過腹腔注射氯胺酮麻醉小鼠, 暴露腹部并解剖肝臟和十二指腸組織. 每種組織分兩部分, 一部分冷凍于液氮中, 用于隨后的組織學(xué)染色分析, 一部分用4%多聚甲醛固定24 h后用于石蠟包埋處理.

1.2.5 肝組織HE染色: 取肝臟石蠟組織, 切為5 μL厚度的切片, 并脫蠟至水后, 根據(jù)HE試劑盒說明書步驟行常規(guī)HE染色, 顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化.

1.2.6 肝組織油紅O染色: 取肝臟石蠟組織, 切為5 μL厚度的切片, 并脫蠟至水后, 根據(jù)HE試劑盒說明書步驟行油紅O染色, 顯微鏡下觀察肝組織油紅O染色情況, 以評估肝組織脂質(zhì)蓄積情況.

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR): 用TRIzol試劑從肝組織中提取總RNA, 并使用Prime Script RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 并以cDNA作為模板,在2×Power SYBR Green PCR體系中分別加入2 μg總RNA、PCR引物, 進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng). 以GAPDH作為內(nèi)參, 用2-ΔΔCT方法計算目的基因相對表達(dá)水平. 本實驗應(yīng)用的PCR引物序列為: PPAR-α(正向):5’-GTGCCTGTCCGTCGGGATGT-3’, PPAR-α(反向):5’-GTGAGCTCGGTGACGGTCTC-3’; 肉堿-棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyltransferase 1a, CPT1a)(正向):5’-CGCTCATGGTCAACAGCAACTACT-3’, CPT1a(反向): 5’-CTCACGGTCTAATGTGCGACGA-3’; 成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)(正向):5’-AGATCAGGGAGGATGGAACA-3’, FGF21(反向):5’-ATCAAAGTGAGGCGATCCATA-3’; GAPDH(正向):5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’, GAPDH(反向): 5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’.

1.2.8 免疫組化檢測: 取石蠟組織, 切為5 μL厚度的切片, 并脫蠟至水后, 根據(jù)免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作. 其中, 肝組織室溫孵育TNF-α、IL-6和IL-1β抗體(1:500)2 h, 小腸組織室溫孵育ZO-1抗體(1:500)1.5 h, 并孵育辣根過氧化物標(biāo)記二抗(1:500)1 h, DAB顯色10 min,蘇木精復(fù)染5 min, 顯微鏡下觀察組織染色情況.

1.2.9 蛋白免疫印跡實驗: 肝組織勻漿后, 加入RIPA緩沖液(150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L 乙二胺四乙酸, 50 mmol/L Tris-HCl, 1%Nonidet P-40, 0.5%脫氧膽酸鈉, 0.1%SDS)萃取蛋白. 蛋白在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離, 并通過半干法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上. 用5%(w/v)脫脂乳室溫下封閉1 h, 然后一抗(ACC、p-ACC、TNF-α和β-Actin抗體, 1:1000)4 ℃孵育過夜, 第二天用洗膜液洗膜后, 用辣根過氧化物標(biāo)記二抗(1:10000)在室溫下孵育2 h. 用洗膜液洗膜后通過ECL發(fā)光液顯現(xiàn)目的條帶, 以β-Actin作為內(nèi)參, 通過Image J量化目的條帶相對表達(dá)量.

統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示, 使用Graphpad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析. 數(shù)據(jù)的多重比較下采用采用方差分析后Fisher's最小顯著差異法(least significant difference, LSD)進(jìn)行比較.P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 胡桃苷對HFD誘導(dǎo)的肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響肝組織以HE染色和油紅O染色分析其炎癥損傷和脂肪變性程度. HE染色結(jié)果(圖1A)顯示, STD組肝組織形態(tài)學(xué)正常, 肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰, 未見炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象; HFD組肝組織中肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清并呈現(xiàn)膨脹壞死現(xiàn)象, 大量混合性炎性細(xì)胞浸潤; 而胡桃苷治療組呈劑量依賴地顯著逆轉(zhuǎn)HFD誘導(dǎo)的肝組織結(jié)構(gòu)變性. 油紅O染色結(jié)果(圖1B)顯示, STD組肝組織未見明顯的油紅O染色; HFD組肝組織中呈現(xiàn)大量油紅O染色液滴, 提示微泡脂肪變性并脂質(zhì)蓄積; 而胡桃苷治療組呈劑量依賴地顯著逆轉(zhuǎn)HFD誘導(dǎo)的肝組織脂質(zhì)蓄積. 以上結(jié)果提示, 胡桃苷可以抑制HFD誘導(dǎo)的小鼠肝組織炎性病變和脂肪變性.

2.2 胡桃苷對HFD誘導(dǎo)的肝功能損傷和血糖穩(wěn)態(tài)紊亂的影響 在肝功能方面(圖2A-C), 相比于STD組, HFD組血清AST、ALT和CHOL含量均上升(P＜0.01), 說明HFD對小鼠肝功能造成了一定程度的損傷; 相比于HFD組,高劑量胡桃苷治療組血清AST(P＜0.05)、ALT(P＜0.01)和CHOL(P＜0.001)含量均下降, 中劑量胡桃苷治療組血清ALT(P＜0.05)和CHOL(P＜0.01)含量下降, 低劑量胡桃苷治療對這三種指標(biāo)AST、ALT和CHOL含量均無顯著影響. 在糖代謝方面(圖2D-F), 相比于STD組, HFD組葡萄糖(P＜0.01)、胰島素(P＜0.001)和IR水平(P＜0.01)指標(biāo)(HOMA-IR)明顯升高; 相比于HFD組, 中、高劑量胡桃苷治療組以上糖代謝相關(guān)指標(biāo)明顯降低(P＜0.05或P＜0.01), 低劑量胡桃苷治療組并未顯示出明顯的治療效果. 以上結(jié)果提示, 胡桃苷能改善HFD造成小鼠肝功能損傷和血糖穩(wěn)態(tài)紊亂.

2.3 胡桃苷對HFD誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)代謝紊亂的影響 RT-qPCR實驗結(jié)果(圖3A-C)顯示, 相比于STD組, HFD組肝組織PPAR-α的mRNA水平以及PPAR-α下游FGF21和以及CPT1a 的mRNA水平均明顯降低(P＜0.01或P＜0.001); 相比于HFD組, 中、高劑量胡桃苷治療組以上指標(biāo)明顯升高(P＜0.05或P＜0.01). 蛋白免疫印跡結(jié)果(圖3D、E)顯示, 相比于STD組, HFD組肝組織ACC的磷酸化水平明顯降低(P＜0.001); 相比于HFD組, 中、高劑量胡桃苷治療組肝組織ACC的磷酸化水平明顯增加(P＜0.05或P＜0.01). 以上結(jié)果提示, 胡桃苷可部分逆轉(zhuǎn)HFD導(dǎo)致的小鼠肝臟脂質(zhì)代謝障礙以及降低其對脂肪酸氧化的影響.

2.4 胡桃苷對HFD誘導(dǎo)的肝組織中炎性因子的影響 在免疫組化結(jié)果(圖4A-C)顯示, STD組小鼠肝組織TNF-α(圖4A)、IL-1β(圖4B)和IL-6(圖4C)的表達(dá)呈低水平或未檢測出, HFD組小鼠肝組織中TNF-α(圖4A)、IL-1β(圖4B)和IL-6(圖4C)表達(dá)呈高水平, 而胡桃苷治療組呈劑量依賴地抑制HFD誘導(dǎo)的肝組織中此三種炎癥因子的水平. 蛋白免疫印記結(jié)果(圖4D)顯示, 相比于STD組, HFD組小鼠肝組織中TNF-α的蛋白表達(dá)量明顯增加(P＜0.001); 相比于HFD組, 中、高劑量胡桃苷治療組肝組織中TNF-α的蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.01;P＜0.001).這些結(jié)果進(jìn)一步驗證了胡桃苷能有效逆轉(zhuǎn)HFD帶來的炎癥的影響. 以上結(jié)果提示, 胡桃苷可抑制HFD導(dǎo)致的小鼠肝臟炎癥因子的合成.

2.5 胡桃苷對HFD誘導(dǎo)的小鼠腸道通透性改變的影響為研究胡桃苷對肝腸軸的影響, 用免疫組化技術(shù)觀察小鼠小腸ZO-1的表達(dá)情況. 免疫組化結(jié)果(圖5A、B)顯示,相比于STD組, HFD組小鼠小腸組織中ZO-1含量明顯降低(P＜0.01); 相比于HFD組, 中、高劑量胡桃苷治療組肝組織中ZO-1的表達(dá)量明顯增加(P＜0.05;P＜0.01). 此結(jié)果說明胡桃苷一定程度逆轉(zhuǎn)了HFD對小鼠小腸通透性的損傷. FITC-dextran結(jié)果(圖5C)同樣顯示, 相比于STD組, HFD組小鼠血液中FITC熒光水平明顯增加(P＜0.01),提示, 腸道通透性明顯增加; 相比于HFD組, 中、高劑量胡桃苷治療組血液中FITC熒光水平明顯降低(P＜0.05;P＜0.01), 提示, 腸道通透性明顯降低. 以上結(jié)果共同提示, 胡桃苷可抑制HFD導(dǎo)致的小鼠腸道通透性增加.

3 討論

NAFLD是一種無癥狀的慢性肝病, 是導(dǎo)致肝功能紊亂的主要原因之一[1]. NAFLD的典型特征是肝細(xì)胞脂質(zhì)積累超過5.5%, 使肝臟對炎癥和損傷過于敏感[9]. NAFLD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷具有廣泛的病理表現(xiàn), 如IR、肝臟脂肪堆積或腸道通透性增加[10]. 已有報道[11], 8 wk HFD誘導(dǎo)NAFLD小鼠的造模時間以模擬肝臟脂肪變性的早期階段. 本研究采用8 wk HFD誘導(dǎo)NAFLD小鼠, 研究結(jié)果顯示, 胡桃苷對肝臟在早期炎癥方面的保護(hù)作用, 并揭示了其在改善肝臟代謝損傷方面的作用.

圖2 胡桃苷劑量依賴性改善高脂飲食造成小鼠肝功能損傷和血糖穩(wěn)態(tài)紊亂. A: 谷草轉(zhuǎn)氨酶水平; B: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平; C: 膽固醇水平; D: 葡萄糖水平; E: 胰島素水平; F: 計算HOMA-IR. aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001 vs HFD group; dP＜0.01, eP＜0.001 vs STD group, n = 6. STD: 標(biāo)準(zhǔn)飲食組; HFD: 高脂飲食組; ALT: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶; AST: 谷草轉(zhuǎn)氨酶; CHOL: 膽固醇; insulin: 胰島素.

圖3 胡桃苷劑量依賴性抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝脂質(zhì)代謝紊亂. A-C: RT-qPCR檢測肝組織PPAR-α、FGF21和CPT1a的 mRNA的含量; D、E: 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織中p-ACC和ACC的蛋白表達(dá). aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001 vs HFD group; dP＜0.01, eP＜0.001 vs STD group,n = 6. STD: 標(biāo)準(zhǔn)飲食組; HFD: 高脂飲食組; PPAR-α: 過氧化物酶體增殖體激活受體α; FGF21: 成纖維細(xì)胞生長因子21; CPT1a: 肉堿-棕櫚?；D(zhuǎn)移酶; ACC: 乙酰輔酶A羧化酶; p-ACC: 磷酸化ACC.

NAFLD早期階段的主要發(fā)病機(jī)制是IR造成肝脂代謝障礙[12]. 本實驗結(jié)果顯示, 胡桃苷能恢復(fù)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性, 降低空腹血糖、胰島素濃度和HOMA指數(shù), 并可抑制AST和ALT等肝損傷標(biāo)志物的增加, 并改善HFD引起的脂肪變性等組織學(xué)改變.

在NAFLD中, 已證實PPAR-α信號途徑發(fā)生改變,HFD的PPAR-α-/-小鼠肝組織的肝細(xì)胞中存在異常的脂質(zhì)積累[13]. 在本實驗中, HFD喂養(yǎng)的小鼠肝臟中PPAR-α表達(dá)降低, 而胡桃苷可恢復(fù)PPAR-α表達(dá)水平. 并且, 我們還發(fā)現(xiàn), HFD喂養(yǎng)可降低ACC的磷酸化. 有文獻(xiàn)[14]指出: ACC是AMPK途徑中的下游調(diào)節(jié)蛋白, 參與調(diào)節(jié)CPT1a活性. AMPK誘導(dǎo)ACC磷酸化, 使丙二酰輔酶A(Malonyl-CoA)合成減少. Malonyl-CoA的減少反過來又降低了對肝臟CPT1a的抑制, 從而促使脂肪酸充分進(jìn)入線粒體氧化[15]. 在這里, 我們發(fā)現(xiàn)胡桃苷增加了ACC的磷酸化和肝臟CPT1a的轉(zhuǎn)錄, 而這兩者都被HFD顯著降低. CPT1a表達(dá)的水平的上升與其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PPAR-α的恢復(fù)一致. 并且, 我們還觀察到, 胡桃苷治療不僅增加了PPAR-α的表達(dá)水平, 而且還恢復(fù)了其下游調(diào)節(jié)基因FGF21在肝臟中的表達(dá). FGF21是一種細(xì)胞因子, 其轉(zhuǎn)錄受PPAR-α調(diào)節(jié)[16]. FGF21是肝臟脂質(zhì)氧化和甘油三酯代謝的關(guān)鍵蛋白[17]. 綜上, 我們的數(shù)據(jù)表明胡桃苷可增加脂肪酸代謝能力和并提高胰島素敏感性.

由脂質(zhì)積聚觸發(fā)的肝細(xì)胞炎癥是導(dǎo)致NAFLD進(jìn)展至肝細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟之一[18]. 在我們的研究中,還證實了胡桃苷在抗肝組織炎性反應(yīng)的作用. 本實驗結(jié)果顯示, 胡桃苷顯著降低了肝臟中的炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的表達(dá), 證實了其抗炎的作用, 這可能與其通過PPAR-α調(diào)節(jié)代謝的能力有關(guān). 脂代謝紊亂、線粒體損傷和氧化應(yīng)激在肝細(xì)胞損傷方面具有重要作用, 其加速了炎癥和NAFLD進(jìn)展[12,18].

圖4 胡桃苷劑量依賴性抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝組織因子合成. A-C: 免疫組化檢測小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平; D: 蛋白免疫印記檢測肝組織中TNF-α的蛋白表達(dá). aP＜0.01, bP＜0.001 vs HFD group; cP＜0.01 vs STD group, n = 6. STD: 標(biāo)準(zhǔn)飲食組; HFD: 高脂飲食組; TNF-α: 腫瘤壞死因子-α; IL: 白細(xì)胞介素.

NAFLD發(fā)病和進(jìn)展過程中的另一個關(guān)鍵因素是腸道內(nèi)毒素. 腸道的完整性主要靠腸上皮細(xì)胞通過微絨毛、緊密連接和抗菌肽等物質(zhì)維持. 包括ZO-1在內(nèi)的緊密連接蛋白是影響各種物質(zhì)從腸道到血液轉(zhuǎn)運的細(xì)胞粘附因子[19]. 當(dāng)腸道通透性增加時, 內(nèi)毒素從門靜脈流入肝臟, 損害肝內(nèi)代謝平衡并引發(fā)組織炎癥[20]. 胡桃苷可以恢復(fù)腸道完整性, 這一點被血漿FITC-dextran水平降低和小腸ZO-1(一種重要的緊密連接蛋白, 被HFD喂養(yǎng)后顯著降低)表達(dá)增加所證明.

總之, 本實驗表明, 胡桃苷能夠抑制HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性和早期肝損傷、減少炎癥并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝, 最后, 本研究也證明了胡桃苷能夠改善脂肪攝取過多導(dǎo)致的小腸通透性受損. 本實驗結(jié)果還提示, 胡桃苷可能是NAFLD潛在的治療藥物.

圖5 胡桃苷劑量依賴性抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道通透性增加. A、B: 免疫組化檢測小腸中ZO-1表達(dá); C: 通過FITC-dextran檢測小鼠血液中FITC熒光值評估腸道通透性變化. aP＜0.05, bP＜0.01 vs HFD group; cP＜0.01 vs STD group, n = 6. STD: 標(biāo)準(zhǔn)飲食組; HFD: 高脂飲食組;ZO-1: 緊密連接蛋白1.

文章亮點

實驗背景

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為一種世界性公共衛(wèi)生問題, 而目前對NAFLD的防治效果并不十分理想. 因此, 需要繼續(xù)對抗NAFLD藥物進(jìn)行繼續(xù)篩選.

實驗動機(jī)

在果糖誘導(dǎo)的肝炎大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn), 胡桃苷可抑制果糖誘導(dǎo)的肝損傷和肝炎. 推測, 胡桃苷可能具有改善NAFLD的作用. 而, 胡桃苷對NAFLD中作用的研究尚未見報道.

實驗?zāi)繕?biāo)

以高脂飲食(high fat diet, HFD)誘導(dǎo)小鼠NAFLD, 觀察胡桃苷對HFD誘導(dǎo)的肝損傷、肝炎、脂質(zhì)代謝紊亂以及小腸通透性受損的影響, 并分析其中的機(jī)制.

實驗方法

收集小鼠血液樣品, 并分離血清, ELISA檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽固醇、空腹血糖和空腹胰島素水平. FITC-Dextran檢測腸道通透性. 收集肝組織, HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化; 油紅O染色觀察肝組織脂質(zhì)蓄積情況; 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測肝組織過氧化物酶體增殖體激活受體α(peroxisome proliferatorsactivated receptors, PPAR-α)、成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)以及肉堿-棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyltransferase 1a, CPT1a)的mRNA水平; Western blot檢測肝組織乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase, ACC)磷酸化水平以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表達(dá); 免疫組化檢測肝組織TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-6表達(dá).收集十二指腸組織, 免疫組化檢測小腸組織緊密連接蛋白1表達(dá)情況.

實驗結(jié)果

胡桃苷可改善HFD誘導(dǎo)的肝炎性反應(yīng)和肝脂質(zhì)沉積, 并降低肝損傷與胰島素抵抗, 增加肝臟PPAR-α、FGF21和CPT1a的mRNA水平和ACC的磷酸化水平. 并且, 胡桃苷能恢復(fù)了腸道屏障的完整性.

實驗結(jié)論

胡桃苷可恢復(fù)HFD引起的肝脂肪變性和減少肝損傷, 并能恢復(fù)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和改善十二指腸的腸道完整性.

展望前景

在小鼠NAFLD模型中發(fā)現(xiàn), 胡桃苷可抑制肝脂肪變性和肝損傷、減少炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝, 且能改善小腸通透性受損, 這些結(jié)果提示, 胡桃苷是潛在的抗NAFLD藥物.