高效液相色譜法測定香瓜中甜蜜素的殘留量

王東旭，鄭龍華，徐雅倩，于曼璐，黃 哲，史曉麗，張曉燕，＊

1.通化師范學(xué)院 （通化 134002）

2.通化海關(guān) （通化 134001）

甜蜜素，其化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，溶于水，是一種人工合成的食品甜味劑，可用于食品生產(chǎn)中［1－］。甜蜜素的甜度是蔗糖的30～40倍［2］，由于其價格較低，一些瓜農(nóng)為改善香瓜口感，提高商品價值，在香瓜種植過程中噴施甜蜜素［3－5］。甜蜜素使用的安全性在國際上一直都存在爭議［6］。阿德萊德大學(xué)腸胃神經(jīng)研究實驗室高級博士后研究員兼研究報告合著者之一理查德·楊表示，到目前為止的研究顯示，甜蜜素等人工增甜劑短期內(nèi)對人體的影響似乎有限，不過對于糖尿病患者和代謝能力較弱的小孩、孕婦和老人等特殊人群有一定的影響［7－8］。甜蜜素主要影響人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)這些敏感部位，因此很多發(fā)達國家，例如美國、日本、加拿大等，都明令禁止食品生產(chǎn)商在食品中添加甜蜜素，從根本上阻止甜蜜素流入市場，對人體產(chǎn)生危害［9］。我國只是對一些加工食品在使用范圍上進行了控制，對于香瓜這種即食食品并不在使用范圍內(nèi)，由于監(jiān)管存在漏洞，許多瓜農(nóng)又缺乏正確使用甜蜜素的知識，因此瓜農(nóng)在種植過程中不規(guī)范噴施甜蜜素的現(xiàn)象比較嚴重，導(dǎo)致香瓜中甜蜜素過量殘留［10］。香瓜作為人們茶余飯后的一種美食，被大部分人喜愛［11］。如果殘留甜蜜素的香瓜在市場上大量銷售，可能直接危害到特殊人群的健康，因此制定相關(guān)標準，對香瓜中甜蜜素殘留進行監(jiān)管十分必要。

目前我國檢測甜蜜素的方法有柱前衍生－液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜與蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法、離子色譜法、分光光度法、高效液相色譜法等多種檢測方法。李欣，李幫銳，丁力［12］等選用固相萃?。瓪庀嗌V法測定白酒中甜蜜素的殘留量；肖晶［13］等選用高效液相色譜－質(zhì)譜法測定酒中甜蜜素的殘留量。但是對于香瓜中甜蜜素殘留量的研究并不多見。本課題利用甜蜜素在酸性條件下與亞硝酸鈉反應(yīng)，生成環(huán)己醇亞硝酸酯的特性，采用高效液相色譜法對香瓜中是否殘留甜蜜素進行定性檢測，并根據(jù)標準曲線進行殘留量的定量測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料和試劑

香瓜，購于通化市明達超市；甲醇，色譜純，Thermo Fisher Scientific；硫酸，分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；正己烷，分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；甜蜜素標準品，250 mg，中國食品藥品檢定研究院，純度99.0%，產(chǎn)品編號C11830800，Lot：30426。

1.1.2 儀器

FA1104電子天平，感量0.1 mg，上海恒平有限公司；BT125D 電子天平，感量0.01 mg，上海中庸檢驗設(shè)備有限公司；DHG－9101－3S 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；LC－20A 高效液相色譜儀，日本島津有限公司，紫外檢測器；KQ2200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BDC－218UN 冰箱，海信電器。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

將香瓜去皮去瓤，切碎后放入研缽中研磨成均勻糊狀，準確稱量5 g（精確至0.001 g）樣品于150 mL錐形瓶中，加70 mL 純化水，超聲1 h，冷卻至室溫，將樣品全部轉(zhuǎn)移置100 mL 容量瓶中并用純化水稀釋定容，搖勻，將樣品過濾到錐形瓶中，棄去初濾液。精密吸取續(xù)濾液20 mL 置于分液漏斗中，將分液漏斗置于冰浴中，加入5 mL 硫酸溶液（100 g／L）和5 mL 亞硝酸鈉溶液（50 g／L），搖勻后，在冰浴中放置30 min，并且經(jīng)常搖動進行衍生化。然后精密加入10 mL 正己烷和5 g氯化鈉，混勻后振搖1 min，等氣泡消失后，取上清液，用0.45μm的濾膜過濾，作為樣品溶液，待測。

1.2.2 標準品溶液的制備

準確稱取50 mg 甜蜜素標準品（精確至0.001 g），置于10 mL 容量瓶中，加適量純化水溶解，然后用純化水定容至刻度，配制成5.0 mg／mL的甜蜜素標準品溶液。精密量取適量甜蜜素標準品溶液稀釋10倍，將稀釋10倍后的甜蜜素標準品溶液按1.2.1處理，作為甜蜜素標準品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 色譜條件的選擇

1.3.1 流動相的選擇

根據(jù)查閱參考文獻內(nèi)容，本實驗分別設(shè)置甲醇∶水（V∶V＝70∶30）、甲醇∶水（V∶V＝75∶25）和甲醇∶水（V∶V＝80∶20）三個比例的流動相進行樣品測定，結(jié)果分離度和色譜峰形都比較好，基本能有效的排除干擾峰的影響，但是，甲醇∶水（V∶V＝80∶20）這個比例的流動相出峰時間最快，所以選用甲醇∶水（V∶V＝80∶20）做為流動相。

1.3.2 檢測波長的選擇

利用紫外分光光度計對衍生反應(yīng)生成的環(huán)己醇亞硝酸酯在200～700 nm 范圍內(nèi)進行波長掃描，在210 nm 和314 nm 處都出現(xiàn)了比較明顯的色譜峰，但210 nm 周圍產(chǎn)生的雜峰多，分離度較差。在314 nm 處出現(xiàn)的干擾峰較少，基線相對穩(wěn)定，所以采用314 nm 作為甜蜜素的檢測波長。

1.3.3 流速的選擇

分別選擇0.800 mL／min、1.000 mL／min、1.200 mL／min作為檢測時的流速，經(jīng)檢測，流速為0.800 mL／min時，甜蜜素的保留時間較好，并能得到較好的分離，故選用0.800 mL／min作為樣品檢測的流速。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

分別精密吸取甜蜜素標準溶液和樣品溶液各10μL注入液相色譜儀，根據(jù)甜蜜素標準溶液和樣品溶液峰保留時間做定性分析，結(jié)果如圖1。

圖1 甜蜜素標準品與樣品的色譜圖

由圖1可知，甜蜜素標準品在6.195 min處出現(xiàn)明顯的色譜峰，樣品在6.203 min處出現(xiàn)明顯的色譜峰，根據(jù)色譜峰保留時間可以判定此樣品中檢出甜蜜素殘留。

2.2 精密度試驗

精密吸取樣品溶液10μL 注入色譜儀，進行檢測，并且平行進樣六次分別檢測，得到6組峰面積數(shù)據(jù)，結(jié)果如表1。

由表1可知，6次進樣相對平均標準偏差RSD＝1.8%，結(jié)果表明本試驗方法的精密度較好。

2.3 標準曲線的繪制

將標準品溶液以不同體積梯度2μL、4μL、8μL、16μL、64μL進樣分析，以峰面積作為縱坐標y，進樣體積為橫坐標x，繪制標準曲線，結(jié)果如圖2。

圖2 甜蜜素標準曲線圖

由圖2 可知，獲得標準曲線回歸方程為y＝2 358.9x＋1 454.5，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.999 8，甜蜜素在2～64μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性試驗

將剛提取的樣品溶液分別于0h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h進行測定，結(jié)果如圖3。

由圖3可知，樣品溶液在0～14 h時內(nèi)，峰形未發(fā)生明顯變化，紫外吸收在逐漸減小，計算各時間段色譜峰面積相對標準偏差RSD＝1.8%，說明主成分相對穩(wěn)定，其穩(wěn)定性能夠滿足測定的要求。

圖3 樣品穩(wěn)定性色譜圖

2.5 樣品中甜蜜素殘留量測定

精密吸取樣品溶液10μL注入液相色譜儀進行檢測，將檢測結(jié)果代入標準曲線回歸方程，計算得出，樣品中甜蜜素的殘留量為5.48 mg／kg。

2.6 回收試驗

將樣品分別精密秤取5 g放入1號、2號、3號錐形瓶，再使用微量移液器分別將標準品按照相當于200μg、300μg、400μg的量加入1號、2號、3號瓶中，按照1.2.1方法進行處理。將加標樣品溶液進行檢測，并帶入標準曲線回歸方程進行計算，結(jié)果如表2。

加標樣品1 2 3加標量／（μg／g） 0.2 0.3 0.4回收率／% 88 86 86平均值／% 87相對標準偏差／% 1.54

由表2可知，測得回收率分別為1號88%，2號86%，3號86%，平均回收率為87%，相對標準偏差RSD＝1.54%。其數(shù)值介于我國國家標準GB／T 27404—2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測規(guī)定的回收率（80%～110%）之間，由此得出本試驗方法符合回收率要求，方法可靠。

2.7 檢出限測定

將標準品溶液分別稀釋制成0.05μg／mL、0.1μg／mL、0.2μg／mL濃度的溶液，精密吸取上述溶液，分別進樣進行測定，信噪比達到3時，濃度為0.1μg／mL，基線平穩(wěn)，因此判定甜蜜素的定量檢出限為0.1μg／mL。

3 結(jié)論

本課題利用甜蜜素在酸性條件下與亞硝酸鈉反應(yīng)，生成環(huán)己醇亞硝酸酯的特性，建立高效液相色譜法進行檢測。選用島津ODSInertsil－C184.6×250 mm色譜柱，柱溫30℃，甲醇：水（V∶V＝80∶20）作為流動相，檢測波長為314 nm，流速0.80 mL／min的條件下測定香瓜中甜蜜素殘留量。根據(jù)實驗定性分析可以確定本課題研究所用香瓜中殘留甜蜜素，通過實驗得出精密度的相對標準偏差RSD＝1.8%，獲得標準曲線y＝2 358.9x＋1 454.5，其相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 8，在2～64μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；定量檢出限為0.1μg／mL，檢出限較低；甜蜜素的平均回收率為87%，達到國家標準關(guān)于食品理化檢測回收率的規(guī)定。

綜上所述，本課題建立高效液相色譜測定香瓜中甜蜜素殘留量的方法精密度較高、靈敏性和重復(fù)性好，操作方法簡單快捷。測得本課題研究所用樣品中甜蜜素殘留量為5.48 mg／kg，未查閱到國家對香瓜中甜蜜素殘留量的要求，所以香瓜應(yīng)屬于不得添加甜蜜素的食品，判定為不符合要求。香瓜在東北地區(qū)水果消費中占比較大，尤其是在夏季。因此香瓜中甜蜜素的殘留問題不容忽視，香瓜的食用安全問題值得相關(guān)部門重視。高效液相色譜法在水果中甜蜜素殘留的檢驗中具有實際應(yīng)用價值，希望能為日后相關(guān)人員研究甜蜜素的殘留方面提供相應(yīng)參考。