皂角苷對(duì)銅綠假單胞菌降解土壤PAHs的影響

楊 倫，吳智勇，陳靈澤，胡凱璐，孫超男，張 棟

(杭州電子科技大學(xué) 材料與環(huán)境工程學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程系，浙江 杭州 310018)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)具長(zhǎng)期污染、生物蓄積及“三致”效應(yīng)，1976年美國(guó)環(huán)保署率先將16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物，也是我國(guó)優(yōu)先控制的68 種污染物之一。PAHs污染土壤會(huì)導(dǎo)致土壤功能受損，危害人和生態(tài)安全，急需有效修復(fù)[1]。微生物修復(fù)因成本低、效果好、二次污染少等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[2]，但PAHs生物有效性低，限制了微生物修復(fù)的應(yīng)用[3-4]。生物添加和增效試劑強(qiáng)化是提高微生物修復(fù)效率和程度的有效途徑[5-6]，但目前其作用機(jī)制、界面過程調(diào)控及其聯(lián)合作用，均尚不清楚。因此，本文以銅綠假單胞菌和皂角苷為降解菌和表面活性劑代表，研究了銅綠假單胞菌對(duì)PAHs的降解和吸附性能，探明了皂角苷對(duì)土著微生物降解和銅綠假單胞菌添加后PAHs去除效果的影響，探討表面活性劑對(duì)生物添加增效修復(fù)PAHs污染土壤的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

芘純度>95%，菲、苊純度97%，皂角苷純度BR，均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；萘純度99%，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；主要試劑理化性質(zhì)見表1。

表1主要試劑理化性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

液相降解：向500 mL滅菌三角瓶中加入350 mL滅菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基，含1.0 mg·L-1菲、106CFU·mL-1銅綠假單胞菌和系列濃度皂角苷(0～4 CMC)。在25℃，150 r/min恒溫振蕩14 d，每2天取樣分析菌體生長(zhǎng)、菌體表面疏水性、液相及菌體菲的含量。

吸附：稱取5 mg失活菌體于22 mL樣品瓶?jī)?nèi)，加入20 mL系列PAHs溶液(含0～4 CMC皂角苷)，25℃ 150 r/min恒溫振蕩，離心分離后測(cè)定上清液中污染物的濃度。

土壤降解：稱取1.5 g污染土壤于22 mL樣品瓶，加入20 mL系列皂角苷溶液(0～4000 mg·L-1)，25℃ 150 r/min恒溫振蕩7 d，測(cè)定土壤中污染物的濃度。

1.3 分析方法

PAHs采用高效液相色譜儀(Agilent 1260)測(cè)定，配PAHs專用色譜柱(4.6×250 mm)，流動(dòng)相為甲醇/水混合(95∶5,v/v)；熒光檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)見表1。生物量采用比濁法測(cè)定600 nm吸光度OD600[3]。細(xì)胞疏水性(cell surface hydrophobicity,CSH)利用吸附法測(cè)定[7]，取4 mL清洗復(fù)懸菌液(濃度記OD600,i)至8 mL樣品瓶，加入1 mL正己烷，渦旋混合20 s后靜置30 min，取水相測(cè)定OD600,f，按下式計(jì)算細(xì)胞疏水性。

2 結(jié)果與討論

A: 生長(zhǎng)量和菲濃度; B:吸附-降解率和細(xì)胞疏水性

圖1 銅綠假單胞菌對(duì)菲的吸附-降解

圖2 假單胞菌對(duì)PAHs的等溫吸附系數(shù)與PAH性質(zhì)的關(guān)系

研究了銅綠假單胞菌對(duì)溶液中菲的吸附-降解性能，如圖1。假單胞菌可以菲為唯一碳源生長(zhǎng)，OD600在第3天達(dá)到0.412。隨時(shí)間增加，碳源逐漸減少，細(xì)菌數(shù)量開始下降，第15天OD600降到0.214。同時(shí)，CSH逐漸減小，由第1天的31.2%降低至第15天的4.7%。銅綠假單胞菌對(duì)菲的利用表現(xiàn)為顯著的先吸附后降解，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3-4]。吸附率在第3天已經(jīng)達(dá)到平衡，維持在12.9%～16.3%；細(xì)菌對(duì)菲降解率在第15天達(dá)到77.9%。

研究了銅綠假單胞菌對(duì)PAHs的吸附性能，細(xì)菌對(duì)4種PAHs的吸附均表現(xiàn)出較好的線性，主要以分配作用為主，其吸附系數(shù)(Kd)依次為1564.9、1706.8、10786和12668 L·kg-1，與PAHs的疏水性(logKow)呈顯著正相關(guān)(logKd=0.66logKow+0.892，如圖2)，與文獻(xiàn)報(bào)道規(guī)律一致[8-9]。

A:細(xì)菌生物量；B:菲濃度

圖3顯示了皂角苷對(duì)銅綠假單胞菌吸附菲的影響，皂角苷增大了菌體對(duì)菲的吸附量。菌體CSH只有4.7%(圖1B)，表現(xiàn)為相當(dāng)強(qiáng)的親水性，皂角苷分子由親水端與細(xì)菌表面結(jié)合，將疏水端暴露在外，從而提供了額外的疏水分配相[4]。

研究了皂角苷對(duì)土壤PAHs降解的影響，如圖4，低濃度(100 mg·L-1以下)皂角苷促進(jìn)了菲和芘的去除，而高濃度皂角苷抑制其降解。生物添加銅綠假單胞菌后，并未表現(xiàn)出促進(jìn)降解或?qū)υ斫擒沼懈媚褪苄?。進(jìn)一步研究了皂角苷對(duì)銅綠假單胞菌降解菲的影響(圖5)，可以看出低濃度皂角苷(4 CMC，即140 mg·L-1以下)基本上降低了細(xì)菌的生長(zhǎng)量，也降低了細(xì)菌對(duì)菲的降解，主要是表面活性劑-PAHs復(fù)合物、自身或增溶毒性導(dǎo)致[10-12]。結(jié)果說明，雖然銅綠假單胞菌具有良好的吸附、降解PAHs性能，但土壤微生物的競(jìng)爭(zhēng)以及皂角苷的毒性作用，導(dǎo)致其并不能在土壤中發(fā)揮作用，因此，在實(shí)際土壤修復(fù)中添加專性降解菌是需要慎重考慮的。

3 結(jié)論

本文發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌可高效降解溶液中菲(可達(dá)77.9%)，假單胞菌對(duì)PAHs的吸附系數(shù)與PAHs的logKow呈線性正相關(guān)(logKd=0.66logKow+0.892)。低濃度皂角苷(100 mg·L-1以下)可增加土壤中菲和芘的降解，但會(huì)抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)和降解PAHs能力。銅綠假單胞菌加入土壤中并不會(huì)促進(jìn)土壤PAHs的降解，也沒有顯示出對(duì)高濃度皂角苷的耐受性，生物添加法在實(shí)際應(yīng)用中需慎重考慮。