響應(yīng)面法優(yōu)化五指毛桃多糖的提取工藝

唐 森，黃 霞，覃逸明，吳國(guó)勇，張 鵬*

(1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西 來(lái)賓 546119； 2.廣西科技師范學(xué)院 特色瑤藥資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 來(lái)賓 546119； 3.廣西科技師范學(xué)院 科研管理處，廣西 來(lái)賓 546119)

五指毛桃，來(lái)自?？崎艑僦参锏母稍锔秩~榕的葉形如五根手指，其果實(shí)則狀如毛桃，因此被稱(chēng)為五指毛桃，又因其根部有椰奶的清香，又被稱(chēng)為五指牛奶、牛奶木、土黃芪等等，是一種藥食同源的藥用植物。是嶺南地區(qū)習(xí)用中草藥[1]。中醫(yī)認(rèn)為，五指毛桃性平、味甘、辛，對(duì)脾虛浮腫、肺癆咳嗽、食少無(wú)力、風(fēng)濕痹痛、盜汗、產(chǎn)后無(wú)乳等癥有很好的療效，應(yīng)用歷史悠久，在廣東、廣西、香港等地民間常用其作為煲湯的食材，其保健作用廣為認(rèn)可[2]。研究表明，五指毛桃還具有止咳、平喘、祛痰、益氣健脾、改善消化、保肝、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、補(bǔ)血、抗突變等生物活性[3-4]。多糖是一種天然高分子化合物，具有廣泛的生物活性，在華夏很多中藥材都以多糖作為主要成分之一，近年來(lái)引起各界的關(guān)注。

目前常用的植物多糖提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助溶劑提取法、微波輔助溶劑提取法、超聲-微波協(xié)同提取法、酶解法、超臨界流體萃取法等[5-6]。水熱提取法是目前最常用的植物多糖提取方法，它具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、提取產(chǎn)物綠色無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)采集數(shù)據(jù)，采取多元二次回歸方程進(jìn)行擬合自變量和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程的計(jì)算分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法，其預(yù)測(cè)結(jié)果可信度高，能夠快速確定多因素系統(tǒng)的最佳實(shí)驗(yàn)條件[7]。本試驗(yàn)以五指毛桃作為原料，蒸餾水作為提取劑，采用水浴提取法對(duì)五指毛桃水溶性多糖進(jìn)行提取，并在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，確定水浴提取法提取五指毛桃水溶性多糖的最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五指毛桃購(gòu)于亳州市眾益堂中藥材銷(xiāo)售有限公司，經(jīng)廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張鵬博士鑒定為五指毛桃，試驗(yàn)所用葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水多用真空泵(SHZ-D(III)型 鞏義市科瑞儀器有限責(zé)任公司)；恒溫水浴鍋(HH-S4型 金壇市醫(yī)療儀器廠)； 數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300DB型 昆山市超聲儀器有限公司)； 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-9600型 北京北分瑞利分析儀器(集團(tuán))公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H3-20KR型 湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；電子分析天平(FA-2004B 型 上海越平科學(xué)儀器有限公司)； 玻璃儀器氣流烘干器(C-20型 上海貝侖儀器設(shè)備有限公司)； 中草藥粉碎機(jī)(FW-135型 天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 五指毛桃多糖的提取

將塊狀的五指毛桃用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，80目過(guò)篩后在干燥箱內(nèi)烘干至恒重，備用。精確稱(chēng)取預(yù)處理后五指毛桃固體粉末2.00 g于錐形瓶中，按照試驗(yàn)所需的液料比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行提取試驗(yàn)，所得提取提取液經(jīng)真空抽濾、稀釋、離心，所得溶液即為五指毛桃粗多糖溶液。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8]

采用苯酚-硫酸法顯色，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，回歸方程為：A = 0.0832C-0.1704，R2= 0.9994，線性范圍為3.75～11.25 μg·mL-1。

1.3.3 五指毛桃多糖提取率的測(cè)定[9]

吸取2 mL五指毛桃粗多糖提取液于容量瓶中，加入適量蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)芪? mL五指毛桃粗多糖稀釋液于具塞試管中，加入Savage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)，混勻，2000 r·min-1離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)至刻度試管中，得到供試品溶液。按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算五指毛桃粗多糖溶液中多糖的濃度，按下式計(jì)算五指毛桃粗多糖溶液中多糖的含量：

式中：C為粗提物樣液葡萄糖質(zhì)量濃度(μg·mL-1)，D為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量(μg)。V為最初樣品定容體積，mL。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

探究提取時(shí)間、提取溫度、液料比對(duì)五指毛桃中水溶性多糖提取率的影響。固定液料比60∶1 mL/g，提取溫度80℃，設(shè)定提取時(shí)間30、60、90、120、150 min；固定液料比60∶1 mL/g，提取時(shí)間60 min，設(shè)定提取溫度50、60、70、80、90℃；固定提取溫度80℃，提取時(shí)間60 min，設(shè)定液料比40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、100∶1 mL/g。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在最佳單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇主要的3個(gè)因素：提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)為自變量，以水溶性多糖提取率為主要目標(biāo)，利用Design-Expert 8.0.6的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并確定水浴提取方法的最佳工藝條件，如表1所示為響應(yīng)面設(shè)計(jì)測(cè)試因子的水平和編碼表。

表1 響應(yīng)面因素與水平

1.6 驗(yàn)證工藝

選取響應(yīng)面試驗(yàn)得出的最優(yōu)提取工藝，平行3組，計(jì)算多糖提取率，以確定五指毛桃多糖的最優(yōu)提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定液料比60 mL/g，提取溫度80℃，考察提取時(shí)間為30，60，90，120 min時(shí)的多糖提取率。如圖1所示，提取時(shí)間60 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值，1.12%。當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，多糖提取率呈下降趨勢(shì)。因此最佳提取時(shí)間為60 min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率影響

2.2 提取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定料液比60 mL/g，提取時(shí)間60 min，考察提取溫度為50，60，70，80，90℃時(shí)的多糖提取率。如圖2所示，提取溫度80℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值，1.35%。溫度升高說(shuō)明分子之間的運(yùn)動(dòng)更劇烈，反應(yīng)的效率更快，在較高的溫度里，多糖的溶解度也會(huì)增大，當(dāng)繼續(xù)提高溫度時(shí)，多糖提取率就會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明溫度過(guò)高，導(dǎo)致提取率下降，所以選取80℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率影響

2.3 液料比單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定提取溫度80℃，提取時(shí)間60 min，考察液料比為40∶1，50∶1，60∶1，80∶1和100∶1 mL/g時(shí)的多糖提取率。如圖3所示，液料比60∶1 mL/g時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值1.18%。當(dāng)水量繼續(xù)增加時(shí)多糖提取率反而呈下落的趨勢(shì)，可能是由于溶劑量太大，影響了對(duì)五指毛桃多糖的溶出度，從而影響了多糖的提取率。因此提取最佳液料比為60∶1 mL/g。

圖3 液料比對(duì)多糖提取率影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素試驗(yàn)考察，本次實(shí)驗(yàn)共有分為兩種類(lèi)型的17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，第一類(lèi)為析因點(diǎn)，是自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，析因點(diǎn)共有12個(gè)。第二類(lèi)為位于區(qū)域中心的各自變量均為零水平的重復(fù)試驗(yàn)點(diǎn)，用來(lái)檢驗(yàn)回歸方程與中心試驗(yàn)點(diǎn)的擬合情況，同時(shí)可以提供剩余自由度，以提高試驗(yàn)的精度，本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)的零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。對(duì)計(jì)算出的試驗(yàn)條件按步驟 1.3 進(jìn)行多糖提取試驗(yàn)，求得相應(yīng)條件下的多糖提取率，以 Design expert 8.0.6.1 版軟件對(duì)所得試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，所得結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)條件及結(jié)果

在試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上以 A(提取時(shí)間)、B(提取溫度)、C(液料比)為自變量，Y(提取率)為響應(yīng)值，求得多糖提取率對(duì)三因子的擬合回歸方程為Y=1.29+0.075A+0.00375B-0.041C+0.063AB+0.013AC-0.010BC-0.066A2-0.19B2-0.12C2。

表3 響應(yīng)面分析結(jié)果

注：*p<0.05 表示差異顯著，**p<0.01 表示差異極顯著。

模型的方差分析由軟件Design-Expert 8.0.6完成，結(jié)果如表3所示，分析表格中的數(shù)據(jù)，通過(guò)P值來(lái)判斷[17]，發(fā)現(xiàn)擬合出的方程中各個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值的影響是顯著性的。由表3能夠得出，回歸模型極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.242>0.05)，R2=0.9948，結(jié)果表明，此模型具有良好的擬合程度，每一個(gè)單因素變量與響應(yīng)值之間都存在著顯著的線性關(guān)系，可以用來(lái)預(yù)測(cè)和分析出響應(yīng)面值，分析多糖的提取率?；貧w方程的各項(xiàng)方差分析表明，A、AB對(duì)五指毛桃水溶性多糖有極顯著的影響(P<0.01)，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)提取率的影響極顯著(P<0.01),說(shuō)明五指毛桃多糖與各個(gè)因子之間不僅僅是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。因子C的作用顯著(P<0.05)，因子B、AC、BC對(duì)五指毛桃水溶性多糖提取率無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.4.2 等高線圖及響應(yīng)面圖分析

由圖 4相關(guān)因素的3D響應(yīng)面圖及等高線圖結(jié)合可看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，五指毛桃多糖提取率逐漸增大，當(dāng)溫度低于80℃時(shí)，多糖提取率隨著溫度的升高而增大，這是因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透、溶解、擴(kuò)散速度加快，溶液對(duì)多糖的溶解度增大。然而當(dāng)溫度溫度高于80℃后，由于高溫使熱穩(wěn)定性差的多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生降解從而造成多糖提取率降低。以上這三個(gè)因素對(duì)多糖的提取率都有一定的影響，其中影響最為顯著的是提取的時(shí)間，其次到液料比，受影響最小的是提取的溫度，在等高線圖中，提取溫度跟提取時(shí)間橢圓形狀最為明顯，這就說(shuō)明提取溫度跟提取時(shí)間之間的相互作用對(duì)多糖提取率的影響較大，提取時(shí)間跟提取液料比之間的相互作用次之，而提取溫度跟時(shí)間之間的交互作用幾乎為圓形，說(shuō)明這兩個(gè)因素之間的相互作用對(duì)多糖的提取率影響不大。

圖4 液料比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)五指毛桃多糖提取率影響的響應(yīng)面與等高線

Fig.4 Response surface and contour line of the effect of liquid-material ratio,extraction time and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharide from five-fingered mulberry peach

2.4.3 響應(yīng)面模型驗(yàn)證

根據(jù)軟件Design-Expert 8.0.6預(yù)測(cè)的五指毛桃多糖提取最佳工藝為：提取時(shí)間83.14 min，提取溫度82.03℃，液料比54.16∶1 mL/g。在該條件下五指毛桃多糖提取率的理論值可達(dá)1.31244 %?？紤]到試驗(yàn)的實(shí)際操作性，將提取條件修正為時(shí)間83 min，溫度82℃，液料比54∶1 mL/g。試驗(yàn)重復(fù) 3 次，所得五指毛桃多糖實(shí)際提取率為1.312%±0.005%，該結(jié)果與理論值較為吻合。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化五指毛桃水溶性多糖的提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的二元多項(xiàng)式回歸方程的擬合度較好，由其預(yù)測(cè)并根據(jù)實(shí)際情況修正得到五指毛桃水溶性多糖最佳的提取工藝條件為：提取時(shí)間83 min，提取溫度82℃，液料比54∶1 mL/g。在此條件五指毛桃水溶性多糖的提取率為1.312%±0.005%。由此可見(jiàn)，采用水浴

提取法提取，結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化參數(shù)，是水溶性多糖提取的一種可靠有效的方法?？梢?jiàn)，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化五指毛桃多糖提取工藝參數(shù)切實(shí)可靠，為后續(xù)進(jìn)一步研究提供相應(yīng)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期開(kāi)發(fā)為藥物或保健食品。