川芎赤芍對腦缺血大鼠血管生成素及低氧誘導因子表達的影響

馬進　甘雨　袁媛　黃赫　喬鐵　劉曼玉　褚麗　田淼淼

1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院腦一科,遼寧沈陽110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學方劑教研室,遼寧沈陽110032

川芎赤芍對腦缺血大鼠血管生成素及低氧誘導因子表達的影響

馬進1甘雨1袁媛1黃赫1喬鐵2劉曼玉2褚麗2田淼淼2

1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院腦一科,遼寧沈陽110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學方劑教研室,遼寧沈陽110032

目的探討川芎赤芍對腦缺血再灌注大鼠血管生成素-1（Ang-1)及低氧誘導因子-1α（HIF-1α)表達的影響。方法將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、川芎赤芍組、尼莫地平組,以“Zea Longa線栓法”造成腦缺血再灌注大鼠模型。假手術組、模型組給予生理鹽水,川芎赤芍組給予川芎赤芍提取液,尼莫地平組給予尼莫地平溶液,酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)法測定大鼠血清Ang-1水平,實時熒光定量PCR法檢測HIF-1α mRNA的表達。結果ELISA法測定大鼠血清Ang-1顯示:給藥3、7、14 d,模型組Ang-1水平較假手術組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；給藥3、7、14 d,模型組Ang-1水平顯著低于川芎赤芍組、尼莫地平組,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。實時熒光定量PCR檢測HIF-1α mRNA顯示:給藥3、7、14 d,模型組HIF-1α mRNA表達較假手術組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；給藥3、7、14 d,模型組HIF-1α mRNA表達水平顯著低于川芎赤芍組、尼莫地平組,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。結論川芎赤芍可顯著升高血清中Ang-1水平及腦組織中HIF-1α mRNA的表達,其治療腦梗死可能與促進腦血管新生有關。

腦缺血;血管生成素-1;低氧誘導因子-1α;川芎;赤芍

腦梗死是由于腦局部血液供應障礙,引起病變血管供血區(qū)腦組織缺血、缺氧、壞死,引起一系列生理、生化與病理的級聯(lián)反應,如興奮毒性、細胞凋亡、自由基損害等。臨床研究發(fā)現(xiàn),腦梗死患者生存時間以及預后與梗死后腦組織的微血管密度呈正相關,缺血區(qū)周邊微血管密度高的患者比密度低的患者生存期長,預后好[1-2],因此血管新生作為改善腦組織血流供應的一種有效方法,對腦梗死患者的預后十分關鍵。川芎赤芍是經(jīng)典名方經(jīng)常一起使用的藥對,兩藥臨床常配伍運用,具有行氣活血的功效,現(xiàn)代研究提示二者對腦缺血有調節(jié)作用。本研究探討川芎赤芍配伍應用對腦缺血再灌注大鼠血管生成素-1（Ang-1)及低氧誘導因子-1α（HIF-1α)的影響,并與尼莫地平片進行比較分析,探討川芎赤芍配伍治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

雄性SD大鼠96只,周齡8～10周,體重（250± 30)g,購于遼寧長生生物技術有限公司,動物合格證號:211002300010781,動物許可證號:SCXK（遼) 2015-0001。大鼠飼養(yǎng)在遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院（以下簡稱“我院”)實驗動物中心,溫度20～23℃,相對濕度50%～60%。按照隨機數(shù)字表將其分為假手術組、模型組、川芎赤芍組、尼莫地平組,每組24只。假手術組、模型組分別給予生理鹽水、川芎赤芍組予川芎赤芍提取液,尼莫地平組予尼莫地平液,每日2次,連續(xù)給藥。

1.2實驗藥物與試劑

川芎和赤芍由我院臨床藥學實驗室制成湯劑備用。川芎、赤芍提取液濃度為1.08 g生藥/mL。陽性對照藥尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司,批號: 150166),尼莫地平片配制成濃度1.08 mg/mL的溶液。Ang-1酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)試劑盒（北京誠林生物科技有限公司,批號:E-30570)；MagNA Pure LC RNA Isolation Tissue（Roche,批號:12234000)。

1.3主要儀器

羅氏全自動核酸提取系統(tǒng)（Roche,MPLC2.0)；實時熒光定量PCR儀（Roche,LC480)；羅氏組織勻漿儀（Roche,LR56495)；電熱恒溫培養(yǎng)箱（廈門醫(yī)療電子儀器廠,出廠編號:82062)；低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司,型號:TD5A-WS)。

1.4模型制備

線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型[3]:3%水合氯醛腹腔注射麻醉后,SD大鼠仰臥固定于手術臺上,頸部正中切口,暴露右側頸總動脈,分離頸內、外動脈,在頸內外動脈分叉處結扎頸外動脈,右側頸總動脈處剪口,插入頭端圓鈍直徑為0.28 mm的MCAO栓線,進栓線長度18～19 mm,在大腦中動脈起始端線栓大鼠大腦中動脈。栓塞2 h后取出MCAO栓線。

1.5取材與標本處理

各組于給藥第3、7、14天分別處死大鼠8只。處置方法:3%水合氯醛腹腔麻醉,腹主動脈取血,每次取血4～5 mL,全血放在室溫中靜置30 min左右后3000 r/min,離心10 min,用移液器分離血清至EP管中,記號筆標上記號,放入-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。取血后將各組大鼠斷頭處死,立即取出腦組織后除去嗅球、小腦、腦干,取出右側缺血腦組織,置-80℃冰箱進行凍存。

1.6腦梗死面積(TTC染色)

將各組大鼠在7 d后進行斷頭取腦,去除嗅球、小腦、低位腦干,大鼠用3%水合氯醛麻醉后,斷頭取腦,將大鼠大腦置于-20℃冷凍20 min后,去掉嗅球、小腦和低位腦干,冠狀切分腦組織成5片。用2%的紅四氮唑將腦片染色,37℃培養(yǎng)箱中避光染色30 min,期間不斷翻轉腦片,使兩面染色均勻。正常腦組織呈紅色,而梗死腦組織則為白色。

1.7觀察指標

采用ELISA法測定大鼠血清Ang-1水平,采用實時熒光定量PCR法檢測缺血腦組織HIF-1α的表達情況。

1.8統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理,計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s)表示,經(jīng)方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗,組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD法檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組腦梗死面積比較

假手術組:大腦紅染,未發(fā)現(xiàn)任何白色梗死區(qū)域；模型組、川芎赤芍組、尼莫地平組各組均出現(xiàn)不同面積的白色梗死灶,模型組梗死面積最大,川芎赤芍組、尼莫地平組白色梗死灶面積較模型組明顯減小,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。見表1、圖1。

表1　各組腦梗死面積百分比的比較（%,±s)

表1　各組腦梗死面積百分比的比較（%,±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05；與假手術組比較,#P＜0.05

組別只數(shù)7 d后梗死面積假手術組模型組川芎赤芍組尼莫地平組8 8 8 8 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 2 9 . 5 0 ± 4 . 0 3 1 4 . 6 4 ± 5 . 7 7*#1 0 . 9 3 ± 2 . 2 8*#

圖1　TTC染色大鼠腦切片

2.2各組血清血管生成素-1水平比較

給藥3、7、14 d,模型組Ang-1水平較假手術組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；給藥3、7、14 d,模型組Ang-1水平顯著低于川芎赤芍組、尼莫地平組,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；給藥3、7、14 d,川芎赤芍組、尼莫地平組Ang-1水平較假手術組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05),提示川芎赤芍對腦缺血損傷有治療作用,可能是通過調節(jié)與血管再生有關因子的變化,改善了側支循環(huán)的建立。見表2。

表2　各組血清血管生成素-1水平比較（pg/mLs)

表2　各組血清血管生成素-1水平比較（pg/mLs)

注:與模型組比較,*P＜0.05；與假手術組比較,#P＜0.05

組別只數(shù)3 d 7 d 1 4 d假手術組模型組川芎赤芍組尼莫地平組8 8 8 8 2 3 3 . 6 3 ± 5 3 . 0 0*3 7 1 . 0 0 ± 6 5 . 1 7 4 5 4 . 1 3 ± 8 7 . 6 0*#4 4 6 . 3 8 ± 6 7 . 0 8*#2 4 9 . 3 8 ± 4 4 . 9 6*4 0 1 . 1 3 ± 3 9 . 1 9 4 6 7 . 2 5 ± 6 7 . 3 6*#4 5 5 . 7 5 ± 5 6 . 1 1*#2 5 6 . 8 8 ± 4 3 . 4 4*3 7 6 . 0 0 ± 7 0 . 8 4 4 4 5 . 8 8 ± 5 9 . 9 6*#4 3 6 . 0 0 ± 5 7 . 9 7*#

2.3各組缺血腦組織中HIF-1α mRNA相對表達量水平變化比較

給藥3、7、14 d,模型組HIF-1α mRNA表達較假手術組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；給藥3、7、14 d,模型組HIF-1α mRNA表達水平顯著低于川芎赤芍組、尼莫地平組,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；給藥3、7、14 d,川芎赤芍組、尼莫地平組HIF-1α mRNA含量較假手術組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。模型組、川芎赤芍組、尼莫地平組給藥7 d HIF-1α mRNA含量與本組給藥3 d時比較,差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05),模型組、川芎赤芍組、尼莫地平組給藥14 d HIF-1α mRNA含量與本組給藥3 d時比較,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。見表3。

表3　各組缺血腦組織中HIF-1a mRNA相對表達量水平變化比較（±s)

表3　各組缺血腦組織中HIF-1a mRNA相對表達量水平變化比較（±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05；與假手術組比較,#P＜0.05；與本組給藥3 d比較,△P＜0.05

組別只數(shù)3 d 7 d 1 4 d假手術組模型組川芎赤芍組尼莫地平組8 8 8 8 1 . 0 9 ± 0 . 1 2*1 . 2 3 ± 0 . 0 7 1 . 4 3 ± 0 . 0 8*#1 . 3 2 ± 0 . 0 7*#1 . 0 8 ± 0 . 1 2*1 . 3 7 ± 0 . 0 9△1 . 6 0 ± 0 . 1 0*#△1 . 5 1 ± 0 . 0 8*#△1 . 1 2 ± 0 . 0 8*1 . 3 3 ± 0 . 0 6 1 . 5 2 ± 0 . 0 7*#1 . 3 7 ± 0 . 0 7*#

3　討論

血管生成素（Ang)是一族蛋白質分子,Ang-1是該家族成員之一,主要表達在血管旁細胞。通過Tie-2的磷酸化,Ang-1觸發(fā)血管周細胞和血管內皮細胞之間的相互作用,從而促進新生血管的穩(wěn)定和重塑。Ang/Tie信號通路在生理性、病理性血管生成過程中均發(fā)揮著重要的作用。Ang-1在血管新生過程中發(fā)揮重要作用。Ang-1和受體Tie-2相結合后,活化的內皮細胞能吸引血管平滑肌細胞和周細胞等形成完整的血管壁,促進血管新生[4-6]。Ang-1可以通過增加血管內皮細胞間連接的緊密性,減少血管的滲漏,從而減輕炎性反應。莊越等[7]發(fā)現(xiàn)Ang-1可能通過減輕腦血管炎性反應過程和維持血管內皮細胞完整性來減輕腦血管內皮細胞缺血再灌注損傷,從而起到保護作用。任虹宇等[8]結果提示,神經(jīng)干細胞移植能夠有效促進腦出血恢復期大鼠神經(jīng)功能的恢復,其機制可能與增加出血周圍腦組織促血管生成素及酪氨酸激酶受體2的含量有關。Ang-1是一種能夠抵抗血管滲漏的內源性蛋白質因子,它能抵抗炎癥以及血管內皮生長因子（VEGF)引起的血管滲漏,對VEGF促血管新生的功能有促進和互補作用,且并不影響血管的正常形態(tài),長期高濃度的Ang-1對健康無明顯不利影響[9]。研究顯示,大鼠腦缺血再灌注7 d后,大腦患側皮層Ang-1和Tie-2蛋白表達升高,給予莫諾苷治療后,Ang-1和Tie-2蛋白表達水平進一步增加[10]。電針“百會”“水溝”“后三里”能有效對抗腦缺血再灌注損傷,其作用機制可能與促進HIF-1α及VEGF在海馬的表達、調節(jié)腦缺血再灌注后血管新生進程有關[11]。丹龍醒腦方能夠促進腦缺血再灌注大鼠缺血腦組織血管新生,對缺血腦組織具有保護作用,其作用機制可能與上調Ang-1蛋白表達有關[12]。大鼠腦缺血后VEGF、Ang-1和Ang-2共同協(xié)調作用促進血管生成,中藥腦泰方在腦缺血損傷后治療血管新生樣作用中發(fā)揮著促進作用[13]。

1992年首次發(fā)現(xiàn)HIF-1,Semenza等[14]在缺氧誘導的Hep3B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn),它是由氧分壓調控的α亞基和基礎性表達的β亞基構成的異源二聚體。HIF-1是細胞與組織為適應低氧壓力環(huán)境產生的轉錄因子。HIF-1的活性主要通過HIF-1α的蛋白水平來調節(jié)。氧分壓正常時,HIF-1α被脯氨酸羥化酶快速羥基化,而后在蛋白酶體中降解；低氧分壓時,PHD活性降低,HIF-1α在胞漿中蓄積,與HIF-1β結合形成HIF-1后進入細胞核,與低氧反應元件結合,調控下游靶基因表達。在機體對低氧代償?shù)恼{節(jié)機制中, HIF-1是重要的細胞轉錄因子,在細胞氧穩(wěn)態(tài)的調節(jié)過程中起到了核心作用。缺氧是誘導HIF-1表達的強因素,在腦缺血條件下內皮細胞上的HIF-1 mRNA表達明顯增加。HIF-1的活性對于組織缺血后的恢復是非常重要的。HIF-1可以通過上調與血管新生系統(tǒng)相關蛋白的基因表達,如促進血管生成的VEGF及其受體,如誘導型一氧化氮合酶血紅素氧化酶-1等來增加血流,降低缺血損傷。HIF-1是細胞與組織為適應低氧環(huán)境所產生的轉錄因子。HIF-1通過調節(jié)一系列基因,參與了血管生成、葡萄糖代謝、鐵代謝及細胞增殖與存活等。腦缺血缺氧時,HIF-1α表達增多可以增加血液、氧及營養(yǎng)的供應。有研究顯示在大鼠中動脈閉塞模型基因敲除大鼠,HIF在神經(jīng)元的激活經(jīng)過了一個雙相過程,在缺血后6 h達到高峰,1 d時下降,但2 d后又持續(xù)升高至8 d的時候再下降[15]。

研究表明川芎、丹參、當歸、三七、紅花這些活血化瘀藥都有促血管新生和保護血管的作用,能增加血管密度,促進腦梗死急性期側枝循環(huán)的建立,減少后遺癥的發(fā)生[16-17]。通絡救腦注射液及其有效組分梔子苷、三七總皂苷均可通過抗氧化作用有效減輕內皮細胞擬缺血損傷,提高細胞活性[18]。經(jīng)檢索《普濟方》數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng),同時含川芎赤芍的方劑高達3546首[19],現(xiàn)代藥理研究提示,兩藥合用對腦缺血有調節(jié)作用[20]。腦缺血后腦微血管的完整性對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與修復有明顯作用,川芎赤芍可能通過升高Ang-1水平及HIF-1α mRNA的表達,對腦缺血后微血管的修復新生起作用,進而起到改善腦微循環(huán)的作用。

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Influence of Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra on the expression of angiogenin and hypoxia inducible factor in rats with cerebral ischemia

MA Jin1GAN Yu1YUAN Yuan1HUANG He1QIAO Tie2LIU Manyu2CHU Li2TIAN Miaomiao2
1.The First Department of Cerebropathy,the Second Hospital Affiliated to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang110034,China;2.Teaching and Research Section of Formulas of Chinese Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang110032,China

Objective To investigate the effect of Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra on expression of angiogenin-1(Ang-1)and hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)in rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods SD rats were randomly divided into sham group,model group,Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group, Nimodipine group.The model of rat with cerebral ischemia was established with Longa line plug method.Rats in sham group and model group were given normal saline,rats in Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group were administrated with Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra extracting solution.Rats in Nimodipine group were administrated with Nimodipine Solution.Ang-1 in rat serum was tested with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)method.The expression of HIF-1α mRNA was detected with real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR).Results Ang-1 in rat serum with ELISA method showed that:the Ang-1 levels of model group after administration for 3,7,14 days were increased compared with those of sham group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the Ang-1 levels of model group after administration for 3,7,14 days were lower than those of Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra group and Nimodipine group,the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of HIF-1α with RT-PCR showed that:the expression of HIF-1α of model group after administration for 3,7,14 days were increased compared with those of sham group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the expression of HIF-1α of model group after administration for 3,7, 14 days were lower than those of Rhizoma Chuanxiong and Radix PaeoniaeRubra group and Nimodipinegroup,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Rhizoma Chuanxiong and Radix Paeoniae Rubra can significantly enhance Ang-1 in serum and HIF-1α mRNA expression in brain tissue,suggesting that the mechanism of cerebral ischemia may be related to promoting angiogenesis.

Cerebral ischemia;Angiogenin-1;Hypoxia inducible factor-1α;Rhizoma Chuanxiong;Radix Paeoniae Rubra

R743.3

A

1673-7210(2016)06(b)-0008-05

遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2013362)。

馬進（1976-),女,博士,中國中醫(yī)科學院博士后,遼寧中醫(yī)藥大學杏林杰出青年,副主任醫(yī)師,碩士研究生導師；研究方向:腦血管疾病中西醫(yī)結合基礎與臨床研究。

（2016-02-19本文編輯:張瑜杰)