4株綠僵菌的鑒定及對(duì)松褐天牛成蟲致病效果比較*

張亞波 張 威 張守科 彭 瀚 孟 珂 舒金平 王浩杰

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 富陽 311400； 2. 河南科技學(xué)院 新鄉(xiāng) 453003)

松褐天牛(Monochamusalternatus)屬鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)墨天牛屬(Monochamus)，是馬尾松(Pinusmassoniana)、濕地松(P.elliottii)等松屬植物主要的蛀干害蟲，其成蟲也是松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)的主要傳播媒介，在松材線蟲病的發(fā)生和擴(kuò)散過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Stampsetal.， 2001； 展茂魁等， 2014)。

防治松褐天牛、切斷松材線蟲的侵染循環(huán)是松材線蟲病綜合治理的關(guān)鍵。松褐天牛幼蟲鉆蛀為害，隱蔽性較強(qiáng)，幼蟲期防控難度較大，防治幼蟲不僅耗費(fèi)較高的成本，而且防控效率較低(史先慧等， 2017)。松褐天牛成蟲羽化后會(huì)鉆出樹干自由活動(dòng)，進(jìn)行補(bǔ)充營養(yǎng)和交尾產(chǎn)卵，同時(shí)傳播松材線蟲，成蟲期防控可以降低松褐天牛數(shù)量、減少松材線蟲對(duì)松樹的感染(趙錦年等，1989； 林長春等， 2002)。

綠僵菌(Metarhiziumspp.)和白僵菌(Beauveriaspp.)是應(yīng)用最為廣泛的2類昆蟲病原真菌，在農(nóng)、林以及衛(wèi)生害蟲的防治中越來越受到人們的重視(Donaldetal.， 2004； 張亞波等， 2014)。關(guān)于白僵菌防治松褐天牛方面已取得較多進(jìn)展(張立欽等， 2000； Shimazu， 2004； 劉洪劍， 2007)，釋放的生防菌株能夠定殖于生態(tài)系統(tǒng)中，且有取代土著菌株優(yōu)勢地位的趨向(趙學(xué)球等， 2007)。但利用綠僵菌防治松褐天牛的研究報(bào)道相對(duì)較少，何學(xué)友等(2007； 2008)分離篩選到了感染松褐天牛的9個(gè)金龜子綠僵菌菌株，潘永勝等(2010)篩選到了3個(gè)綠僵菌菌株。綠僵菌與白僵菌相比，綠僵菌具有較強(qiáng)的耐高溫和耐旱特性(江英成， 2000； 宋漳等， 2003)。所以，挖掘?qū)λ珊痔炫８叨玖Φ木G僵菌菌株具有重要的應(yīng)用前景。

由于不同學(xué)者所采用的菌株標(biāo)本并非同一模式，綠僵菌有關(guān)屬種的形態(tài)描述存在不一致的情況，致使在綠僵菌分類地位的研究中出現(xiàn)了許多爭議(Rezendeetal., 2015)。單純依靠形態(tài)特征來對(duì)綠僵菌屬種進(jìn)行分類，很難將綠僵菌相近的種區(qū)分開來，利用分子生物學(xué)的研究技術(shù)有助于解決綠僵菌屬近緣種的分類難題。延伸因子EF-1α是真菌普遍存在和參與蛋白質(zhì)翻譯的蛋白，由于EF-1α編碼基因序列在種內(nèi)具有較高的保守性，而在不同種間具有規(guī)律性的進(jìn)化差異，因此，EF-1α基因序列被廣泛地應(yīng)用于真菌近緣種的鑒定以及真菌遺傳多樣性分析(Bischoffetal., 2009； Kepleretal., 2014； 郭慶港等， 2018)。本文選用幾株產(chǎn)孢好的綠僵菌菌株對(duì)松褐天牛成蟲進(jìn)行生物測定，同時(shí)進(jìn)行形態(tài)學(xué)和EF-1α編碼基因序列分析，重新明確4株綠僵菌的分類地位，旨在篩選出對(duì)松褐天牛成蟲具有高毒力的菌株，同時(shí)探討了施菌方式對(duì)致病性的影響，為生物防治松褐天牛奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及飼養(yǎng)

松褐天牛成蟲為馬尾松蟲害木置于室外不銹鋼紗網(wǎng)的養(yǎng)蟲籠飼養(yǎng)羽化所得，蟲害木主要來自浙江省杭州市富陽區(qū)。供試松褐天牛成蟲為3～5日齡、個(gè)體大小基本一致，并按日齡大小平均分配到各處理中。試蟲用新鮮的1年生馬尾松嫩枝在開有通氣孔的透明塑料杯 (上口12 cm、下口8 cm、高15 cm) 中單頭飼養(yǎng)，每天換1次嫩枝。

1.2 供試菌株

1)綠僵菌WP08菌株，由中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所森林健康與保護(hù)研究室分離，提交中國科學(xué)院微生物菌種保藏中心(CGMCC No.4226)專利保存，該菌株分離自篩胸梳爪叩甲(Melanotuscribricollis)幼蟲僵蟲體上。

2)綠僵菌LV2菌株，由海南熱帶植物研究所提供，該菌株分離自椰心葉甲(Brontispalongissima)僵蟲體上。

3)綠僵菌WTKH菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，分離寄主不詳。

4)綠僵菌qc1401菌株，該菌株由作者分離自蠐螬(Popilliasp.)幼蟲僵蟲體上，保存在中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所森林健康與保護(hù)研究室內(nèi)。

1.3 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基為PPDA(去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蛋白胨10 g、水1 000 mL)。Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司； PCR引物合成及序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 綠僵菌形態(tài)特征觀察

在無菌條件下，挑取少量分生孢子粉，加10 mL的0.05%Tween 80溶液配制成孢子懸浮液，振蕩混勻后用血球計(jì)數(shù)板測定懸浮液中分生孢子濃度，并適當(dāng)調(diào)整使之達(dá)到1.0×108個(gè)·mL-1。各取2 μL孢子懸浮液分別點(diǎn)接于PPDA培養(yǎng)基平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)14天(QHX-300BS-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，觀察記錄菌落特征，在顯微鏡(蔡司生物顯微鏡Primo Star)下觀察菌絲和孢子形態(tài)，測量100個(gè)分生孢子大小。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 EF1α-5’序列的PCR擴(kuò)增及測序 將供試菌株接種PPDA平板，25 ℃下培養(yǎng)14天，刮取孢子，液氮研磨后，利用CTAB法提取總DNA。以之為模板，采用引物EF1T(5′-ATGGGTAAGGARGAC AAGAC-3′)與EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATC ATGTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Rehner and Buckley， 2005)。PCR反應(yīng)體系： 共25.0 μL，其中DNA模板1.0 μL(<1 μg)、EF1T(10 pmol·μL-1)0.3 μL、EF1T(10 pmol·μL-1)0.3 μL、10×Buffer緩沖液(無Mg2+)2.5 μL、Mg2+(25 mmol·L-1)1.5 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)1.5 μL、Taq聚合酶(2.5 U·μL-1)0.15 μL、ddH2O 17.75 μL。PCR擴(kuò)增條件為： 94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s、54 ℃ 40 s、72 ℃ 0 s、30個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測。由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.5.2 序列分析 將獲得的EF-1α基因5’序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，同時(shí)在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，找出與之有最大相似性的幾個(gè)序列，并下載其他幾種綠僵菌的相關(guān)序列。將下載的序列分別和本研究中的4條序列利用MEGA 6.0中ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，采用Neighbor-joining(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中選用的模型是Maximum Composite，運(yùn)用Bootstrap檢驗(yàn)重復(fù)，抽樣1 000次，其余參數(shù)為默認(rèn)選項(xiàng)。

1.6 4株綠僵菌對(duì)天牛的毒力測定

1.6.1 孢子懸浮液配制 將供試綠僵菌置于PPDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天，將真菌的分生孢子粉刮到一個(gè)干凈無菌的盛有10 mL 0.05% Tween 80的三角瓶中，充分振蕩，然后加入無菌水，用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算孢子溶液濃度。供試孢子的萌發(fā)率均在97%以上。

1.6.2 無紡布菌條制作 液體母種參考徐金柱等(2006)方法制作。培養(yǎng)基制作方法參照徐金柱等(2007)，黃豆粉40 g·L-1、白砂糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1，接種量為種子∶輔料=1∶2，25 ℃下，RH 95%培養(yǎng)至產(chǎn)孢。無紡布孢子含量為3.5×108個(gè)·cm-2。

1.6.3 試驗(yàn)條件 試驗(yàn)均在室內(nèi)自然變溫24～33 ℃，相對(duì)濕度40%～60%條件下測定綠僵菌對(duì)松褐天牛成蟲的致病力。試蟲死后保濕培養(yǎng)，觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況。

1.6.4 致病力測定 1)浸枝法： 取健康新鮮的馬尾松1年生嫩枝，洗凈晾干后，分別將供試菌株以0.05%的Tween 80滅菌水配制成濃度為1.0×108個(gè)·mL-1的分生孢子懸浮液，并逐級(jí)稀釋使?jié)舛葹?.0×106、1.0×107、1.0×108·個(gè)·mL-1，將馬尾松嫩枝(直徑0.8 cm、長12 cm)分別在孢子懸液中浸30 s，晾干嫩枝，將其放入消毒的干凈塑料杯中，松褐天牛成蟲接至塑料杯中飼養(yǎng)； 同時(shí)放置棉球保持濕度。以噴0.05%的Tween 80滅菌水的馬尾松嫩枝飼養(yǎng)為對(duì)照，每處理試蟲10頭，重復(fù)3次，處理后每天觀察1次，記錄死亡蟲數(shù)，直至處理后第40天。

2)浸蟲法： 分別將供試4個(gè)綠僵菌菌株以0.05%的Tween 80滅菌水配制成濃度為1.0×108孢子·mL-1的分生孢子懸浮液，采用浸漬法接種(潘永勝等， 2010)，將試蟲在孢子懸浮液中浸1 s進(jìn)行接種，以0.05%的Tween 80滅菌水為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，重復(fù)10頭試蟲。處理后的試蟲放入裝有新鮮馬尾松嫩枝的塑料瓶中飼養(yǎng)，同時(shí)放置棉球保持濕度，每天記錄死亡蟲數(shù)，連續(xù)觀察40天。

3)無紡布法： 為了檢測孢子的飄移是否會(huì)增加天牛成蟲的感染機(jī)會(huì)，在室內(nèi)進(jìn)行觀察試驗(yàn)。以100 cm×100 cm×100 cm尺寸制作養(yǎng)蟲籠，用不銹鋼紗網(wǎng)包裹。籠內(nèi)放置新鮮馬尾松嫩枝飼養(yǎng)天牛； 無紡布菌條固定于籠外30 cm，高50 cm處，使用風(fēng)扇送風(fēng)將孢子吹入籠內(nèi)。處理3個(gè)重復(fù)，以無菌布條為對(duì)照，每天記錄死亡蟲數(shù)，連續(xù)測定觀察40天。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各處理下供試?yán)ハx的死蟲數(shù)，按下式計(jì)算累計(jì)死亡率和校正死亡率：

死亡率(%)=死亡蟲數(shù)/供試總蟲數(shù)×100,

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(100-對(duì)照組死亡率)×100。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Spss 17.0中ProBit進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算半數(shù)死亡時(shí)間LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 4株綠僵菌的形態(tài)特征

4個(gè)供試菌株在PPDA培養(yǎng)基上菌落特征不同，分生孢子形態(tài)及大小差異較大。菌株WP08和WTKH菌落初期邊緣白色，菌絲濃密，中央產(chǎn)生暗綠色、厚而密的分生孢子層，后期2個(gè)菌株分生孢子層顏色不同。WP08后期分生孢子層顏色呈橄欖色，WTKH分生孢子層顏色呈灰褐色； 菌株qc1401和LV2菌落氣生菌絲較多，qc1401菌株培養(yǎng)至后期分生孢子層顏色變淡呈灰橄欖色，LV2分生孢子層顏色呈黑褐色。4個(gè)綠僵菌的分生孢子在形態(tài)上存在一定的差異。WP08、WTKH和LV2菌株的孢子呈長橢圓形，但WP08和WTKH菌株的孢子個(gè)體較小[(4.9～7.2) μm×(1.4～2.8) μm]，LV2菌株的孢子相對(duì)較大[(5.0～8.1) μm×(2.5～3) μm]，qc1401菌株孢子兩端鈍圓，大小為(7.0～9.0) μm×(2.0～3.0) μm(圖1)。

圖1 不同綠僵菌菌株的菌落特征和分生孢子形態(tài)Fig.1 Colony morphology and Conidiospora feature of four Metarhizium spp. isolates

2.2 4株綠僵菌EF1α基因序列分析

對(duì)4個(gè)菌株的EF1α基因5’序列進(jìn)行擴(kuò)增，將所得序列輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，在構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，外群球孢白僵菌獨(dú)立于系統(tǒng)樹的基部，與各綠僵菌菌株的遺傳距離很遠(yuǎn)。供試的綠僵菌菌株聚類為4個(gè)主要組群，即平沙綠僵菌(M.pingshaense)、羅伯茨綠僵菌(M.robertsii)、金龜子綠僵菌(M.anisopliae)和癭綿蚜綠僵菌(M.pemphigi)。供試菌株WTKH和WP08劃分在平沙綠僵菌組群中，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將WTKH和WP08鑒定為平沙綠僵菌； LV2劃分在金龜子綠僵菌組群中，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將其鑒定為金龜子綠僵菌； 菌株qc1401劃分在癭綿蚜綠僵菌組群中，根據(jù)Kepler等(2014)提出的黃綠綠僵菌的分類系統(tǒng)，將其鑒定為癭綿蚜綠僵菌Metarhiziumpemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler。

2.3 松褐天牛綠僵菌侵染特征

松褐天牛成蟲被綠僵菌感染后，最初表現(xiàn)為活動(dòng)遲緩，食量減少，而后停止活動(dòng)，蟲體僵化。保濕培養(yǎng)后從成蟲觸角節(jié)間膜上或從成蟲頭部、胸部、腹部及足部的節(jié)間長出白色菌絲體，最后白色菌絲上出現(xiàn)綠色孢子堆(圖3)。

2.4 不同綠僵菌菌株對(duì)松褐天牛的致死率

采用浸蟲法測定4個(gè)綠僵菌菌株對(duì)松褐天牛的毒力。供試的4個(gè)綠僵菌菌株對(duì)松褐天牛表現(xiàn)出不同程度的致病效果，其中校正死亡率較高的是平沙綠僵菌WP08菌株和金龜子綠僵菌LV2菌株，40天的試驗(yàn)期內(nèi)死亡率達(dá)到100%； 黃綠綠僵菌qc1401死亡率為91.9%，平沙綠僵菌WTKH菌株的校正死亡率為87.9%； 對(duì)照組死亡率為16.67%(表1)。

圖2 基于EF-1α基因5’序列構(gòu)建的綠僵菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Evolution tree of the different Metarhizium strains based on the 5’ end of EF-1α sequences

圖3 松褐天牛被綠僵菌侵染死亡特征Fig.3 Death symptom of M. alternatus infected by Metarhizium spp.

2.5 綠僵菌對(duì)松褐天牛的致死速度

4株綠僵菌采用浸蟲法接種松褐天牛，試驗(yàn)結(jié)果表明4株綠僵菌對(duì)試蟲的致死速度不同，供試綠僵菌中WP08菌株開始致死時(shí)間較早，致死速度較快(圖4)，LT50為5.52天； 其次為LV2菌株的致死速度也較快，LT50為10.38天，qc1401菌株的致死時(shí)間和致死速度相對(duì)較慢，半數(shù)死亡時(shí)間較長，WTKH菌株的致死時(shí)間和致死速度介于LV2和qc1401之間(表1)。

表1 不同綠僵菌菌株對(duì)松褐天牛的毒力測定Tab. 1 Toxicity test of different Metarhizium isolates to M. alternatus

圖4 不同綠僵菌對(duì)松褐天牛的毒力測定Fig.4 Pathogenic effect of different Metarhizium isolates to M. alternatus

2.6 WP08菌株不同孢子濃度致病力分析

以平沙綠僵菌WP08菌株為供試菌株，采用浸枝法接種松褐天牛成蟲，從表2可以看出，孢子濃度越高則半數(shù)死亡時(shí)間越短。當(dāng)孢子濃度為1.0×108個(gè)mL-1時(shí)，半數(shù)死亡時(shí)間LT50為11.38天。隨著孢子濃度的降低，半數(shù)死亡時(shí)間也隨之延長，當(dāng)孢子濃度為1.0×106個(gè)mL-1時(shí)，LT50為24.22天(表2)。從圖5中可以看出，較高孢子濃度可以更早地導(dǎo)致試蟲死亡。在孢子濃度的試驗(yàn)中，從試蟲開始死亡直至試驗(yàn)截止，各個(gè)濃度總會(huì)有一段試蟲集中死亡的時(shí)間，而后死亡速率減慢。部分試蟲集中死亡后，個(gè)別試蟲到試驗(yàn)后期才死亡，累積死亡率曲線呈現(xiàn)對(duì)數(shù)型。

2.7 接種方式對(duì)松褐天牛的致病效果

以平沙綠僵菌WP08為供試菌株，采用浸枝法、浸蟲法和無紡布法均可致試蟲死亡。施菌40天內(nèi)供試松褐天牛死亡率均為100%，浸蟲法的LT50為5.52天； 浸枝法LT50為11.38天； 無紡布法LT50為17.21天。對(duì)照組死亡率為16.67%； 浸蟲法致死速率均高于浸枝法和無紡布法(表3)。

圖5 不同孢子濃度下綠僵菌對(duì)松褐天牛的致病效果Fig.5 Pathogenic effect to M. alternatus in different spore concentrations

表3 綠僵菌不同接種方法對(duì)松褐天牛的致病效果Tab.3 Pathogenic effect to M. alternatus in different inoculation method

3 討論

關(guān)于綠僵菌的分類一直是眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。Tulloch(1976)根據(jù)形態(tài)特征將綠僵菌劃分為金龜子綠僵菌、黃綠綠僵菌(M.flavoviride)和白色綠僵菌(M.album)3個(gè)種。但是，由于綠僵菌屬內(nèi)形態(tài)差異微小，而菌落特征受培養(yǎng)條件的影響，分生孢子大小和形態(tài)存在一定變化范圍，單純依靠形態(tài)特征來對(duì)綠僵菌屬種進(jìn)行分類具有較大局限性(王峰等， 2017)，利用分子生物學(xué)的研究技術(shù)有利于解決綠僵菌屬近緣種的分類難題。Drive和Milner(2000)根據(jù)綠僵菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，將37株綠僵菌同樣劃分為3個(gè)種(金龜子綠僵菌、黃綠綠僵菌和白色綠僵菌)，其中，黃綠綠僵菌下分5個(gè)變種，黃綠綠僵菌癭綿蚜變種M.flavoviridevar.pemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler被首次定名。Kepler等(2014)認(rèn)為僅僅以ITS來分析綠僵菌的系統(tǒng)發(fā)育非常有限，不能有效區(qū)分綠僵菌的近緣種，他采用EF-1α，RPB1，RPB2和β-tubulin多基因進(jìn)化的方法結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對(duì)綠僵菌及其近緣種進(jìn)行了研究，認(rèn)為黃綠綠僵菌癭綿蚜變種與Metarhiziumpemphigi應(yīng)為同物異名，隨即取消了黃綠綠僵菌癭綿蚜變種，改為Metarhiziumpemphigi(Driver & R.J. Milner) Kepler。Nishi等(2017)根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及PCR-RFLP和多基因的系統(tǒng)分析的結(jié)果，同樣認(rèn)為應(yīng)將黃綠綠僵菌癭綿蚜變種改為Metarhiziumpemphigi。本文中qc1401菌株為蠐螬即弧麗金龜(Popilliasp.)幼蟲僵蟲上分離得到，該種曾被鑒定為黃綠綠僵菌癭綿蚜變種Metarhiziumflavoviridevar.pemphigi(張亞波等， 2015)，后因黃綠綠僵菌及其近緣種的重新劃分，本文中對(duì)該菌株重新定名為Metarhiziumpemphigi。本研究中的菌株WP08、WTKH和LV2的孢子顏色和形態(tài)上相近，而在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中劃分兩個(gè)組群，菌株WP08、WTKH聚在平沙綠僵菌分支上，LV2聚在金龜子綠僵菌的分支上。WTKH最初被鑒定為金龜子綠僵菌，本文依據(jù)形態(tài)學(xué)和EF-1α基因序列分析將其重新鑒定為平沙綠僵菌。

松材線蟲病是松樹(Pinusspp.)的一種毀滅性病害，松褐天牛是病原線蟲的主要媒介昆蟲。羽化的松褐天牛有20%～30%攜帶有松材線蟲，羽化10天后松材線蟲開始轉(zhuǎn)移到寄主體內(nèi)，轉(zhuǎn)移期可以持續(xù)79天(Lietal., 2007)。蔣平等(2002)研究表明，線蟲的脫出數(shù)量在松褐天牛成蟲羽化后20～30天最多，前10天傳播的數(shù)量不到總量的10%。而最早產(chǎn)卵時(shí)間為補(bǔ)充營養(yǎng)后的第8天即羽化后第8天，說明在成蟲羽化后14天內(nèi)殺死松褐天牛，才能對(duì)控制松材線蟲病有明顯效果。王四寶等(2004)和何學(xué)友等(2005)室內(nèi)毒力測定的結(jié)果表明，松褐天牛成蟲感染金龜子綠僵菌后第7天就開始死亡，10～15天為死亡高峰期； 而本試驗(yàn)中供試的平沙綠僵菌WP08菌株浸蟲法的LT50為5.52天，5～10天為死亡高峰期，浸枝法的LT50為11.38天，10～15天為死亡高峰期； 金龜子綠僵菌LV2菌株的致病速度也較快，浸蟲法LT50為10.38天，10～15天為死亡高峰期，均具有較大實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

在相同環(huán)境條件下，昆蟲接觸到的病原菌越多，其被感染的幾率越大。本試驗(yàn)中采用了3種施菌方法，浸蟲法使蟲體接觸到的孢子數(shù)量最多，故殺蟲效果最好，其次為浸枝法，而無紡布法孢子數(shù)量相對(duì)較少，其殺蟲效果較差。通常在林間使用噴霧、噴粉法防治森林蛀干害蟲，真菌孢子很難接觸到樹干內(nèi)的幼蟲，而且對(duì)羽化不整齊的天牛成蟲效果常不理想，難以完全發(fā)揮優(yōu)良菌株的效果與作用，這是蛀干害蟲防治中的難題。無紡布法可以延長孢子在林間的擴(kuò)散時(shí)間，在這方面的研究取得了一些進(jìn)展(Tsutsumietal.， 1997； Okitsuetal., 2000； 王濱等， 2003)。本試驗(yàn)中的無紡布法能夠說明孢子的飄移是能夠增加天牛成蟲的感染機(jī)會(huì)，后期還可以結(jié)合天牛的趨性特點(diǎn)選擇相應(yīng)的無紡布顏色開展林間試驗(yàn)。針對(duì)成蟲開展致病力強(qiáng)的優(yōu)良菌株選育并開發(fā)相應(yīng)的施菌技術(shù)，以提高其在天牛等蛀干類害蟲防治中的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

平沙綠僵菌WP08菌株對(duì)松褐天牛致死率高、致死速度快，為防治松褐天牛的優(yōu)良菌株。孢子濃度是影響防效的關(guān)鍵因素，林間應(yīng)用時(shí)，建議綠僵菌孢子濃度應(yīng)在1×108個(gè)·mL-1以上。此外，可采用噴施綠僵菌孢子懸浮液或懸掛無紡布法防治松褐天牛成蟲。