糖苷水解酶7家族蛋白在纖維素降解中作用的研究進(jìn)展

高小曉，孟 虹，李 蓉，李憲臻

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

天然纖維素是由葡萄糖單元以β-1,4-鍵連接組成的一類大分子多糖物質(zhì)，結(jié)構(gòu)上具有無序(不定形)和高度有序(結(jié)晶)區(qū)域。近幾年來，提倡通過綠色環(huán)保的生物法降解纖維素，將其轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖，并被微生物發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，作為化石燃料的替代品。在生物降解中，纖維素的降解是通過不同纖維素酶復(fù)合酶制劑協(xié)同進(jìn)行的[1]。糖苷水解酶7家族(glycoside hydrolases 7 family, GH7)是來源于真菌的纖維素水解酶，包括內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。此家族具有共同的蛋白結(jié)構(gòu)特征，多個loop區(qū)圍繞反向平行的β-折疊形成的β-三明治結(jié)構(gòu)的催化結(jié)構(gòu)域[2]。近年來，有17個GH7蛋白的晶體結(jié)構(gòu)得到解析，可幫助確定酶的催化活性位點、底物識別及結(jié)合位點，從而明確酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，對GH7成員、分類和序列以及三維結(jié)構(gòu)特點與催化纖維素降解功能關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 GH7的分布及組成

目前已報道的GH7蛋白常見于真菌以及部分線蟲體內(nèi)，如尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、稻瘟病菌(Humicolagrisea)、裸露腐霉(Humicolainsolens)和盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)等[3-8]，部分成員除了含有GH7催化結(jié)構(gòu)域外，還含有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate-Binding Domain，CBD)。

GH7成員酶蛋白根據(jù)其作為底物結(jié)合催化區(qū)域不同，可分為作用于不定形區(qū)隨機水解β-1,4-鍵的內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4)和作用于結(jié)晶區(qū)的纖維素鏈末端以持續(xù)水解切割纖維二糖單元的外切葡聚糖酶(又稱纖維二糖水解酶，cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91)兩大酶類。

1.1 GH7內(nèi)切葡聚糖酶

內(nèi)切葡聚糖酶廣泛存在，根據(jù)其保守序列和結(jié)構(gòu)特征分類，其存在于16個糖苷水解酶家族中[9-10]，屬于GH7的內(nèi)切葡聚糖酶，具有廣泛的底物特異性，對纖維素、大麥β-葡聚糖、地衣多糖、海帶多糖和木聚糖均具有催化活性，在各種工業(yè)應(yīng)用中具有潛在的吸引力[11-12]。例如，來源于Asperillufumigatus的GH7內(nèi)切葡聚糖酶對羧甲基纖維素、β-葡聚糖和木葡聚糖均有催化活性，且在極端pH范圍(3.0～8.0)內(nèi)保持高度穩(wěn)定性，55 ℃熱穩(wěn)定性高達(dá)72 h。協(xié)同Celluclast?1.5 L混合雞尾酒法可提高對天然纖維素甘蔗渣、玉米芯、稻草和豆秸的水解效率，使其在第二代生物燃料生產(chǎn)以及其他生物精煉工藝中的復(fù)配酶制劑方面具有重要的應(yīng)用前景[5]。

1.2 GH7外切葡聚糖酶

GH7成員外切葡聚糖酶存在于許多降解纖維素真菌中，是其分泌的降解纖維素酶系中的主要組成部分，可作用于結(jié)晶纖維的還原端，通過持續(xù)性水解單個纖維素鏈而反復(fù)釋放纖維二糖，在纖維素降解過程中起著關(guān)鍵的作用[13-15]。同其他糖苷水解酶一樣，該酶能有效加快晶體纖維素中糖苷鍵的水解速率，可提高約1017倍，使其是目前已知的最高效的催化劑之一。來源于Trichodermareesei的TrCel7A 是研究最為廣泛的外切葡聚糖酶，也是目前商品化復(fù)配纖維素酶制劑的主要成分之一[15]。來源于Penicilliumoccitanis菌株的GH7外切葡聚糖酶則具有更高比活性，預(yù)處理玉米秸稈和微晶纖維素在24～96 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率比TrCel7A的作用提高1.3～1.5倍，同時對纖維二糖和木質(zhì)素衍生化合物的敏感性較小，具有更大的應(yīng)用潛力[16]。

2 GH7蛋白序列特點

相比較于其他的糖苷水解酶家族，GH7成員進(jìn)化具有非常高的保守度。GH7蛋白在真菌和一些低端真核生物，例如變形蟲及甲殼動物等中被發(fā)現(xiàn)，但在原核生物中至今沒有發(fā)現(xiàn)[8]。經(jīng)過十多億年間的分化，生物之間序列仍保持著40%的同源性。同源序列多與底物結(jié)合區(qū)域及活性口袋相關(guān)[8]。Segato等[17]通過研究曲霉來源的2個外切葡聚糖酶，確定Trp38、Tyr168、Asp170、Glu209、Asp211、Glu214、Trp371和Trp380等催化相關(guān)殘基和底物通道相關(guān)氨基酸是完全保守的。GH7成員中，內(nèi)切葡聚糖酶與外切葡聚糖酶相比具有較高序列多樣性，導(dǎo)致其具有較大的結(jié)構(gòu)變異，因此GH7內(nèi)切葡聚糖酶對多種多糖底物有催化能力，具有廣泛的底物特異性。

GH7成員含有多個半胱氨酸且形成大量的二硫鍵。例如來源于Talaromycesemersonii的TeCel7A酶序列中的10個半胱氨酸分別組成5個二硫鍵:Cys4-Cys72、Cys54-Cys191、Cys190-Cys200、Cys243-Cys375和Cys266-Cys320(圖1)[18]。多個二硫鍵有助于維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此GH7成員最適反應(yīng)溫度多為45～65 ℃，且具有較高的熱穩(wěn)定性。如Chaetomiumthermophilum與Acremoniumhermophilum來源的 GH7蛋白最適反應(yīng)溫度為60～65 ℃；TeCel7A的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在60 ℃孵育20 h后仍保持90%酶活性；TeCel7A酶在80 ℃，68 min后，可保持50%的酶活性[19-20]。

圖1 來源于T.emersonii的TeCel7A蛋白結(jié)構(gòu)[18]Fig.1 The three-dimensional structure of TeCel7A from the T.emersonii[18]

3 GH7蛋白結(jié)構(gòu)與功能

目前，PDB數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/)已保存了17個GH7成員的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，盡管表達(dá)GH7成員蛋白的生物種類繁多，但GH7酶的整體折疊具有相似性。GH7蛋白一般含有1個催化結(jié)構(gòu)域，又稱GH7保守結(jié)構(gòu)域(Conserved Domain，CD)和1個CBM(Carbohydrate-Binding Module,CBM)結(jié)合模塊(一般是由35個左右具有很強的序列相似性的氨基酸形成的多肽鏈)[3]。 GH7蛋白催化結(jié)構(gòu)域是由多個loop區(qū)圍繞反向平行的β-折疊形成的β-三明治結(jié)構(gòu)組成。GH7成員內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶均含有此催化結(jié)構(gòu)域，但是這兩種酶具有完全不同的水解特性。催化中心的不同結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶與底物結(jié)合方式及催化過程不同[21]。通過對多個GH7成員的晶體結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)GH7成員內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶主要因為存在于活性中心以外的一些loop區(qū)以及表面區(qū)域的微小的差異，而影響到酶與底物的結(jié)合[3,21-22]。如來源于Trichodermareesei的外切葡聚糖酶TrCel7A在活性中心外含有l(wèi)oop區(qū)，形成封閉的隧道狀活性位點，而內(nèi)切葡聚糖酶TrCel7B缺少活性中心位點上的loop區(qū)，使催化中心成開放的裂縫區(qū)，這使得內(nèi)切葡聚糖酶能夠進(jìn)入纖維素內(nèi)部區(qū)域并將纖維鏈切割成較短的片段成為纖維寡糖，釋放出更多的自由端(圖2)。

圖2 來源于Trichoderma reesei的外切葡聚糖酶TrCel7A(A)和TrCel7B(B)蛋白結(jié)構(gòu)[23]Fig.2 The structures of GH7 enzymes from Trichoderma reesei[23]TrCe17A(A) (PDB Code:4C4C) 和 TrCe17B(B) (PDB Code:1EG1)中重要的loop區(qū)The major loops of TrCel7A (PDB code：4C4C) and TrCel7B (PDB code：1EG1)

CBM結(jié)合模塊在空間結(jié)構(gòu)上通過2～3個二硫鍵穩(wěn)定其三維構(gòu)象，利用CBM結(jié)合模塊的平面上所含有的保守芳香族氨基酸殘基(酪氨酸、色氨酸或組氨酸)與底物纖維素表面結(jié)合[24-25]。但是CBM并不是必須的，部分GH7蛋白有CBM結(jié)合模塊。例如Aspergillus菌屬菌株中同時存在含有CBM結(jié)合模塊和無CBM結(jié)合模塊的兩種GH7外切葡聚糖酶的現(xiàn)象[2]。 Segato等[26]對同一來源的兩個不同GH7外切葡聚糖酶進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，這兩種酶具有高度保守的催化結(jié)構(gòu)域和相似的催化性能，并發(fā)現(xiàn)CBM會影響酶與底物的識別和結(jié)合，含有CBM的Cbh1為與底物結(jié)合酶，而未含有CBM的CelD為非結(jié)合底物酶，且熱穩(wěn)定性高于CelD，并降低葡萄糖的抑制敏感性。

4 GH7蛋白降解纖維素的作用機制

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者通過分子動力學(xué)模建以及透射電子顯微鏡(TEM)和原子力顯微鏡(AFM)等新型技術(shù)及儀器可視化研究GH7蛋白降解纖維素的作用過程[27-28]。GH7外切葡聚糖酶作用于纖維素鏈的還原端，經(jīng)過一系列反應(yīng)水解單纖維素鏈，如圖3所示，水解過程：①GH7外切葡聚糖酶通過其含有的CBM結(jié)合模塊吸附于結(jié)晶纖維素表面;②促使纖維素解聚，形成纖維素單鏈，進(jìn)入酶分子內(nèi)部空腔并與酶的底物結(jié)合位點結(jié)合；③通過活性中心催化三聯(lián)體“EXDXXE”中的Glu212和Glu217，并分別作為親核試劑和酸/堿試劑催化糖苷鍵斷裂，釋放二糖產(chǎn)物；④酶與底物分離。水解過程是一個重復(fù)性的循環(huán)，通過②和③循環(huán)作用，GH7外切葡聚糖酶持續(xù)水解單纖維素鏈，釋放纖維二糖直至單纖維素鏈水解完全。GH7內(nèi)切葡聚糖酶降解纖維素的作用過程與外切葡聚糖酶的過程較一致，不同之處在于底物無需進(jìn)入內(nèi)切葡聚糖酶分子內(nèi)部空腔，因為內(nèi)切葡聚糖酶活性口袋表面缺少封閉的loop區(qū)，促使其采用開放的結(jié)合位點，可快速與底物結(jié)合并催化水解產(chǎn)生寡糖產(chǎn)物。 Liu等[29]利用AFM揭示了GH7外切葡聚糖酶TrCel7A通過其CBM1結(jié)合模塊與結(jié)晶纖維素疏水面結(jié)合，降解纖維素表面單個纖維鏈后，使纖維素表面缺少并留下類似路痕的痕跡的過程。這與內(nèi)切葡聚糖酶作用有著很大的不同。Wang等[30]通過AFM觀察GH7內(nèi)切葡聚糖酶TrCel7B作用纖維素后發(fā)現(xiàn)，纖維素表面粗糙度增加并且纖維體積減少，這揭示了其優(yōu)先水解非結(jié)晶區(qū)纖維，從而暴露結(jié)晶微纖維并為外切葡聚糖酶提供纖維素結(jié)合作用部位——微纖維末端。

圖3 GH7外切葡聚糖酶降解纖維素的作用過程[23]Fig.3 The complete processive cycle of cellulose degradation by GH7 CBH[23]

5 展 望

纖維素是地球上最豐富的可再生資源。利用內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡聚糖酶的多酶體系協(xié)同作用于纖維素降解，將其高效轉(zhuǎn)化為可利用的小分子糖，對于解決目前的資源、環(huán)境和能源危機具有重大意義。近幾年來，從高效降解纖維素的霉菌菌株中發(fā)現(xiàn)其存在著大量的GH7成員，已成為目前復(fù)配纖維素酶制劑制備生物燃料的現(xiàn)代工業(yè)酶的重要基礎(chǔ)。通過對不同來源GH7成員蛋白的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了其結(jié)構(gòu)特點和關(guān)鍵氨基酸對其催化和穩(wěn)定性方面的關(guān)聯(lián)，但現(xiàn)有的酶制劑在催化活性和催化穩(wěn)定性等方面仍難以達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的水平。隨著研究的發(fā)展以及不斷對酶的結(jié)構(gòu)與催化機理的深入了解，未來通過改造可得到更加適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的復(fù)合纖維素酶制劑。