中國明對蝦急性肝胰腺壞死病(AHPND)和池塘水體中弧菌的檢測分析

陳曉玲，邱 亮，魏海英，王君霞，孫成峰，許傳堂

(1.日照市海洋與漁業(yè)研究所，山東 日照 276826；2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)功能實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學與生物安保重點實驗室，山東 青島 266071)

中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)又被稱為東方對蝦，是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類之一[1]。然而，近年來多種病毒性和細菌性疾病的暴發(fā)給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的損失。其中，一種細菌性疾病在亞洲和拉丁美洲等地區(qū)的養(yǎng)殖對蝦中普遍流行，依據(jù)組織病理學特征，這種疾病被命名為急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)[2]。AHPND是目前導致對蝦大量死亡和減產(chǎn)的原因之一，其代表性癥狀是肝胰腺的萎縮和發(fā)白，出現(xiàn)在對蝦放苗后的前30 d，死亡率可以達到100%[3-4]。組織病理學分析顯示，在AHPND感染的早期，能觀察到肝胰腺小管的上皮細胞脫落；在感染的后期，能觀察到肝胰腺小管細胞的壞死以及溶血性滲透現(xiàn)象[5-7]。我國最早于2010年由國家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系首席科學家何建國教授團隊在海南省發(fā)現(xiàn)了AHPND的病例[8]，同年，馬來西亞也報道了此病[4，6]；隨后，2011年和2012年，越南及泰國相繼發(fā)現(xiàn)了該病[2，6，9]；2013年菲律賓和墨西哥的養(yǎng)殖對蝦也受到了該病的困擾[10-11]。2016年，日照地區(qū)首次檢測出中國明對蝦感染AHPND，且造成了一定的經(jīng)濟損失。因此，對日照地區(qū)進行AHPND的監(jiān)測和預防對于該地區(qū)的對蝦養(yǎng)殖業(yè)極其重要。

弧菌病是對蝦養(yǎng)殖過程中危害較大且較為常見的細菌性疾病之一，該病在全國各養(yǎng)蝦地區(qū)普遍流行[12-13]。近年來，專家學者對發(fā)病池塘的池水和病蝦進行弧菌檢測，得出的結(jié)果顯示大多數(shù)發(fā)病池塘中的弧菌數(shù)量都嚴重超標。已報道的相關(guān)病原主要包括哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)等[14-17]，而副溶血弧菌則被認為是引發(fā)AHPND的病原之一[6，18-19]。因此，有效的監(jiān)測水體中弧菌的數(shù)量將是防控AHPND暴發(fā)的一個關(guān)鍵因素。本文中使用的TCBS培養(yǎng)基為特殊選擇性培養(yǎng)基，用來監(jiān)測中國明對蝦池塘水體中弧菌數(shù)量，取得了明顯的效果，為有效控制對蝦AHPND的暴發(fā)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AHPND的檢測

1.1.1 樣品來源

此次調(diào)查選取日照對蝦試驗站中全部的8口中國明對蝦池塘作為取樣點(無論發(fā)病與否，每個池塘都進行取樣)。依據(jù)隨機取樣的原則，每次每口池塘抽取一定數(shù)量的中國明對蝦樣品(其中稚蝦150尾，成蝦30尾)。將采集到的不同蝦池中的樣品分別暫存到聚四氟乙烯袋中，編號并進行充氧，保證其活性，運輸?shù)綄嶒炇抑腥印４舜握{(diào)查取樣從2018年4月放苗開始，一直持續(xù)到9月清塘收蝦，每個月的每周都進行取樣，共采集樣品192份。

1.1.2 樣品前處理

取對蝦的肝胰腺、胃和腸進行研磨，研磨后的組織放入無菌的離心管中于-20℃冰箱冷凍保存或直接放入95%酒精中固定保存。

1.1.3 對蝦總DNA提取

取研磨好的組織樣品約20 mg，按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA提取試劑盒(TaKaRa，大連)的說明書步驟進行總DNA的提取，于-20℃保存。

1.1.4 AHPND致病基因的檢測

根據(jù)Dangtip等[20]報道的方法，用兩對引物采用套式PCR的方法對AHPND的致病基因進行檢測。套式PCR擴增體系為：10×Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTPs(10 mmoL/L)2.0 μL，Ex Taq DNA酶(5 U/μL)(TaKaRa，大連)0.25 μL，待檢樣品DNA 1.0 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各2.0 μL(表1)，加滅菌水補足至25.0 μL。第一輪擴增程序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，進行30個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保溫。第二輪擴增程序：94℃ 2 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，進行25個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保溫。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中AHPND的致病基因序列進行比對，進一步驗證結(jié)果的準確性。

1.2 弧菌檢測

1.2.1 水樣來源

以日照對蝦試驗站中全部的8口中國明對蝦池塘作為取樣點，從2018年4月放苗開始，到9月收蝦，每個月取一次水樣(其中8月為高溫季節(jié)，多取一次水樣)，于每口池塘的表層及中層的位置分別取2份水樣，每個池塘共計4份水樣(池塘的弧菌數(shù)為這4個水樣的平均值)，總共采集224份水樣。

1.2.2 TCBS平板檢測

弧菌檢測方法采用TCBS平板計數(shù)法，即取100 μL養(yǎng)殖用水，均勻涂抹在TCBS瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，35℃倒置培養(yǎng)15 h，計數(shù)，計算得出每mL水體中的弧菌數(shù)量，對可疑菌落可進一步用菌落PCR進行鑒定。TCBS培養(yǎng)基購自北京路橋公司；弧菌科微量生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.3 16S rRNA菌落PCR

菌落PCR擴增體系：10×Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)2.0 μL，Ex Taq DNA酶(5 U/μL)(TaKaRa，大連)0.25 μL，引物16S-F、16S-R(10 mmol/L)各2.0 μL(表1)，挑取單菌落作為模板，加滅菌水補足至25.0 μL。擴增程序：94℃ 10 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。檢測到的陽性PCR產(chǎn)物送去生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序得到的16S rRNA序列分別與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中核酸數(shù)據(jù)進行 BLAST 分析，選取同源性最高的序列及幾種常見模式弧菌的16S rRNA，采用Mega 6軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 AHPND的套式PCR檢測結(jié)果及分析

2018年4—9月，從試驗站的中國明對蝦池塘共采集對蝦樣品192份，對全部樣品進行AHPND的套式PCR檢測和測序驗證，統(tǒng)計結(jié)果見表2。AHPND陽性樣品第一輪擴增片段大小為1 269 bp，第二輪擴增片段大小為230 bp，部分樣品的PCR檢測結(jié)果如圖1所示。將測序所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中AHPND致病基因的序列進行比對，結(jié)果顯示PCR擴增出的陽性產(chǎn)物與NCBI數(shù)據(jù)庫中AHPND致病基因的序列相似性為98%～99%。從表2的檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，7月和8月是AHPND的高發(fā)期，陽性檢出率分別為15.6%、25.0%；其他月份沒有檢出AHPND，陽性檢出率為0%。另外，此次AHPND的檢出主要在K1池塘和K6池塘，其他池塘未有AHPND檢出。檢測到AHPND后，K1和K6池塘通過及時控料、調(diào)水、生物防控等措施，使疫情得到了較好的控制，但中國明對蝦的成活率仍然受到了一定程度的影響。

表2 試驗站中國明對蝦池塘的AHPND檢測結(jié)果

2.2 水體中弧菌數(shù)量變化

2018年4—9月，從日照對蝦試驗站中國明對蝦的8口池塘共取水樣224份，對全部水樣進行TCBS平板檢測，計算出每1 mL養(yǎng)殖水體中所含的弧菌菌落數(shù)，試驗統(tǒng)計結(jié)果見圖2(由于4月無弧菌檢出，未在圖中列出)。從圖中可以看出池塘中弧菌數(shù)量的變化范圍為0～8.6×103cfu·mL-1。其中，在4月剛放完蝦苗后的水樣中，8口池塘均未檢測出弧菌；從5月開始檢測到弧菌的存在，但數(shù)值都比較低，均在1×103cfu·mL-1之內(nèi)；6月大部分池塘的弧菌數(shù)量都有所增加，平均數(shù)值在1.23×103cfu·mL-1左右；7月隨著溫度升高，弧菌數(shù)量呈現(xiàn)明顯增長的趨勢，這種情況一直持續(xù)到9月，變化范圍為1.04×103～8.6×103cfu·mL-1，其中K1和K6兩個養(yǎng)殖池塘的弧菌數(shù)值偏高，這與2.1結(jié)果中AHPND的PCR檢測結(jié)果相一致，通過施用微生態(tài)制劑進行水質(zhì)調(diào)控，9月這兩個池塘的弧菌數(shù)量得到顯著的控制。

注：M表示DNA Marker DL2000；1～11：第一輪PCR結(jié)果；12～23：第二輪PCR結(jié)果。

Notes：M was DNA Marker DL2000；1～11：The first round PCR results；12～23：The second round PCR results.

2.3 16S rRNA 菌落PCR序列分析

2.3.1 16S rRNA電泳擴增結(jié)果

TCBS平板檢測結(jié)果一般顯示兩種顏色的弧菌菌落，包括黃色菌落的溶藻弧菌和綠色菌落的副溶血弧菌。然而，從6月開始，試驗結(jié)果中出現(xiàn)了帶有黑色菌落的平板，其在數(shù)量的分布上不屬于優(yōu)勢菌落，這種情況一直持續(xù)到9月。為了進一步了解此黑色菌落的屬性，試驗將平板上的黑色菌落，用滅菌的接種環(huán)挑取在新的TCBS平板上劃線進行純化培養(yǎng)后，將黑色菌落經(jīng)兩次純化后，挑取作為模板進行16S rRNA 菌落PCR，部分菌落PCR檢測結(jié)果如圖3。

注：M表示DNA Marker DL1000；1～8：樣品編號。

Notes：M was DNA Marker DL1000；1～8：No.of samples.

2.3.2 16S rRNA序列的遺傳進化樹

將圖3中陽性樣品的測序結(jié)果用BLAST進行比對，選取同源性高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)，由系統(tǒng)進化樹看出，通過分離得到的黑色菌落序列與溶藻弧菌的遺傳距離比較近，聚集為一個分支，序列相似性為97%～99%。

3 討論

本文在2018年4月至9月期間，對日照對蝦試驗站的中國明對蝦養(yǎng)殖池塘中弧菌數(shù)量和AHPND的發(fā)病情況進行了調(diào)查與分析。結(jié)果顯示，養(yǎng)殖初期蝦池中的弧菌數(shù)量較低，尤其是4月剛投放蝦苗時，弧菌檢測數(shù)量為0，隨著溫度的升高，在養(yǎng)殖中后期弧菌數(shù)量呈上升趨勢，且有2口池塘的弧菌數(shù)量明顯偏高，而其他池塘中的弧菌數(shù)量的數(shù)值都偏低。雖然有研究表明，傳統(tǒng)蝦池對蝦弧菌病發(fā)生的水體弧菌臨界濃度為1.0×105cfu·mL-1[21]，遠超于本文結(jié)果(0～8.6×103cfu·mL-1)，但是從本文的試驗結(jié)果來看，當弧菌數(shù)量接近1.0×104cfu·mL-1時，中國明對蝦池塘中有2口池塘暴發(fā)了AHPND，且造成了一定的經(jīng)濟損失，由此可見隨著蝦池中弧菌數(shù)量的增多，AHPND暴發(fā)的可能性也會隨之升高。近年，弧菌引發(fā)的病害引起國內(nèi)外專家學者的重視。2013年，國際水產(chǎn)聯(lián)盟(GAA)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)先后宣布，導致AHPND的病原體是副溶血弧菌的特異變種[6，22]。本文中7、8月弧菌數(shù)量有明顯增長的趨勢，但通過各種水質(zhì)改良劑、微生態(tài)制劑改善水質(zhì)，弧菌的數(shù)量得到了有效的控制，避免了AHPND的大規(guī)模暴發(fā)，挽回了一定的經(jīng)濟損失。而本次試驗中TCBS平板中的黑色菌落，經(jīng)菌落PCR測序后的進化分析發(fā)現(xiàn)，其與溶藻弧菌在遺傳進化上比較相近。

近年來，弧菌病作為對蝦養(yǎng)殖中危害較為嚴重的疾病之一，出現(xiàn)逐年嚴重的趨勢。針對這一態(tài)勢，相關(guān)漁業(yè)部門及養(yǎng)殖戶要引起足夠的重視，提高防控意識。1)為防治對蝦弧菌病，應盡可能消除傳染源及切斷傳染途徑，創(chuàng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境，定期檢測水體和蝦體中的弧菌數(shù)量以及蝦體中AHPND的致病基因，這樣才能最大限度阻止對蝦弧菌病的暴發(fā)，提高養(yǎng)殖成功率。2)弧菌病的病原被認為是一種條件致病菌，只有當環(huán)境惡化或處在應激狀況時才會出現(xiàn)致病性[13]，因此要做到及時監(jiān)測水質(zhì)情況，防止病菌大量繁殖和傳播。3)創(chuàng)造良好的水環(huán)境，每次進水必須經(jīng)過過濾和消毒處理。消毒后，應向池中加入有益菌、藻類等生物種類，以期在養(yǎng)殖池內(nèi)形成穩(wěn)定的微生態(tài)群落，完成物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化，建立更加穩(wěn)定的水環(huán)境[23]。4)可投喂乳酸菌、酵母菌等可抑制對蝦腸道內(nèi)弧菌繁殖的益生菌，定期施用一些芽孢桿菌也有益于養(yǎng)殖池水質(zhì)的維持[24]。