軟骨寡聚基質(zhì)蛋白基因多態(tài)性與常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的關(guān)系

王剛 祝雁冰 關(guān)中偉

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病是一種常染色體顯性遺傳性骨軟骨發(fā)育不良，其特征在于關(guān)節(jié)軟骨的退化，軟骨下骨的重塑，骨贅形成和硬化[1]。多種致病機(jī)制與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度和進(jìn)展有關(guān)，早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是指在 40 歲之前發(fā)生的病癥，有很強(qiáng)的遺傳相關(guān)性[2]。從疾病的第一個(gè)癥狀開始，通常需要 10～15 年才能變得嚴(yán)重和衰弱[3-4]。許多候選基因，主要是那些編碼細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的基因，已經(jīng)被鑒定為特發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的潛在易感基因座[5]。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白 ( cartilage oligomeric matrix protein，COMP ) 是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，主要在軟骨和骨組織中表達(dá)[6]。假性軟骨發(fā)育不全 ( pseudoachondroplasia，PSACH ) 和多發(fā)性骨骺發(fā)育異常 ( muffiple epiphyseal dysplaais，MED ) 的患者報(bào)告了 100 多種 COMP 突變，但在已鑒定出 COMP 的外顯子 15，17 和 19 中沒有任何突變[7]。COMP 基因突變與常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病可能存在關(guān)聯(lián)[8]，而且目前的研究認(rèn)為基因多態(tài)性可以影響基因的表達(dá)水平。膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的診斷通常主要基于家族史，臨床表現(xiàn)，體格檢查，放射學(xué)評(píng)估和基因診斷。然而，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的準(zhǔn)確診斷有時(shí)可能很困難，特別是對(duì)于非專業(yè)醫(yī)生而言，并且由于臨床表現(xiàn)在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病個(gè)體之間存在顯著差異，因此大多數(shù)放射學(xué)檢查變化并非疾病特異性且 DNA 檢測(cè)費(fèi)用昂貴且未廣泛使用[9]。然而，尚未探索 COMP 水平變化作為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者的診斷標(biāo)志物。本研究擬探討 COMP 基因多態(tài)性與常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的關(guān)系和 COMP 水平作為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病生物標(biāo)志物的潛在效用。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 確診為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者；患者來自于同一家族；( 2 ) 受試者自愿加入本研究。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎者；( 2 ) 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的者；( 3 ) 不同意參加該研究者；( 4 ) 患有嚴(yán)重的精神疾病者。

二、一般資料

2017 年 3 月至 2018 年 2 月，我院鑒定并招募具有常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的六代家族，招募了來自該家族的 32 例膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者，用于表型評(píng)估和基因分型，還招募了 55 名年齡匹配的健康對(duì)照受試者。所有參與本研究的受試者，均行 X 線片檢查評(píng)估關(guān)節(jié)受損情況 ( 注：獲得六代家族的臨床資料的途徑是本研究團(tuán)隊(duì)所在科室多年來持續(xù)隨訪關(guān)注該家族的工作成果 )。

本研究得到了機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，每位參與者或其法定代表人均簽署書面知情同意書。

三、方法

1. 體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查：所有研究參與者均接受常規(guī)病史和體格檢查，由 3 名副主任醫(yī)師在本院風(fēng)濕免疫學(xué)系獨(dú)立風(fēng)濕病專家的監(jiān)督下進(jìn)行。記錄患者的年齡，疾病持續(xù)時(shí)間，晨僵持續(xù)時(shí)間，關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、關(guān)節(jié)活動(dòng)疼痛指數(shù)和關(guān)節(jié)靜息疼痛指數(shù)。使用 Axiom Aristos VX Plus 手部 X 線片數(shù)字 X 線攝影系統(tǒng) ( 西門子 )，以確定關(guān)節(jié)骨損傷的程度。

2. 基因多態(tài)性分型：使用 Puregene DNA Isolation Kit ( Gentra Systems，Minneapolis，MN，USA ) 根據(jù)制造商的說明提取基因組 DNA。使用 ABI PRISM Linkage Mapping Set v 2.5 HD5 ( Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA ) 對(duì) 400 個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行基因分型。標(biāo)記物的平均雜合度為 0.72%，估計(jì)間距為 10 cm。使用 GeneMapper 軟件程序 ( Applied Biosystems ) 計(jì)算等位基因大小。使用 SAS 程序執(zhí)行等位基因呼叫和分級(jí)。

3. DNA 測(cè)序：使用 Applied Biosystems 3730 DNA 分析儀通過直接測(cè)序確定所有 19 個(gè)外顯子和外顯子-內(nèi)含子連接的 COMP DNA 序列變體。使用 Primer3 程序 ( http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ ) 設(shè)計(jì)用于聚合酶鏈反應(yīng) ( PCR ) 的引物。PCR 反應(yīng)在 50 μl 的最終體積中進(jìn)行，每個(gè)引物含有 0.2 μM， 5 mm Tris-HCl ( pH 8.3 )，5 mm KCl，1.5 mm Mgcl2，0.01 mm EDTA，0.05 mm DTT，200 μM dNTP 和 2.5 μl 位 Taq。擴(kuò)增條件包括在 94 ℃ 下初始變性 3 min，然后在 94 ℃ 下進(jìn)行 20 個(gè)觸地 PCR 循環(huán) 30 s，在 65 ℃ 下 30 s ( 每個(gè)循環(huán)降低 0.5 ℃ )，在 72 ℃ 下 40 s，最后 20 個(gè)循環(huán)，在 94 ℃ 下 30 s，在 55 ℃ 下 30 s，在 72 ℃ 下 40 s ( 表 1 )。

表 1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

4. 血漿 COMP 和抗 CCP 抗體測(cè)定：選擇 32 名膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族的第 4 代、第 5 代、第 6 代膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者。對(duì)照組是從醫(yī)院隨機(jī)選擇的，所選擇的參與者分別與 32 例膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病個(gè)體的年齡相匹配。將 5 ml 靜脈血樣品收集到 IMPROVACUTER?EDTAK2 管 ( IMPROVE MEDICAL Technology，Guangzhou，China ) 中。將血液樣品在室溫下以 2000 g 離心 20 min，在 BY-320C 離心機(jī) ( Baiyang Medical Instrument Company，Beijing，China ) 中保存，并在 -80 ℃ 下保存直至分析。根據(jù)制造商的說明，使用 ImmunoscanCCPlus?酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 ( Euro Diagnostica，Malmo，Sweden ) 分析抗 CCP 水平，并且最小可檢測(cè)濃度為 0.1 U / L。使用 Human COMP 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 ( Kamiya Biomedical Company，Seattle，WA，USA ) 根據(jù)制造商的說明書測(cè)量血清 COMP 水平。最低可檢測(cè)濃度為 0.4 ng / ml，并且測(cè)定內(nèi)和測(cè)定間變異系數(shù)均＜5%。每個(gè)測(cè)量一式三份進(jìn)行。

5. 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分：為了評(píng)價(jià)膝骨關(guān)節(jié)的功能，使用西安大略省和麥克馬斯特大學(xué) ( The Western Ontario and McMaster Universities，WOMAC ) 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，這是一種經(jīng)過驗(yàn)證且廣泛使用的測(cè)量膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者下肢疼痛和功能狀態(tài)的方法。對(duì)疼痛和功能分別使用線性變換對(duì)響應(yīng)進(jìn)行求和并縮放為 0～100。WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎評(píng)分包含三個(gè)分量表，即僵硬亞表 ( 范圍 0～8，最高僵硬水平 8 )，功能亞表 ( 范圍 0～68，最低功能水平 68 ) 和疼痛亞表 ( 范圍 0～20，疼痛最高水平 20 )，分?jǐn)?shù)越高表示疼痛越大，功能越差。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS Version 17.0 軟件 ( SPSS Inc.，Chicago，IL，US ) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用 GraphPad Prism 5.0 軟件將所有數(shù)據(jù)表示為±s。使用非參數(shù) Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和 Student’st檢驗(yàn)確定組間差異。分類數(shù)據(jù)以n個(gè)患者 ( % ) 表示，使用 Pearsonχ2檢驗(yàn)或 Fisher 精確檢驗(yàn)分析分類變量之間的差異。P值＜0.05，被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況

本實(shí)驗(yàn)共納入 87 名受試者，其中 32 名根據(jù)體格檢查和影像學(xué)檢查結(jié)果被診斷為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者，平均年齡為 ( 44.16±9.27 ) 歲，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組性別、年齡、體重和身體質(zhì)量指數(shù)與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05 )，而膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者身高較低，臂跨度較窄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 ) ( 表 2 )。

二、COMP 蛋白結(jié)構(gòu)

COMP 是一種模塊蛋白，由氨基末端卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域、4 種表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)結(jié)構(gòu)域，8 種鈣調(diào)蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域和羧基末端球狀結(jié)構(gòu)域組成，COMP 在哺乳動(dòng)物物種中是非常保守的，并且在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，表明其在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中受到嚴(yán)格控制，并且它是哺乳動(dòng)物軟組織發(fā)育中的重要調(diào)節(jié)因子 ( 圖 1 )。

三、COMP 多態(tài)性

圖 1 COMP 蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 1 COMP protein structure

表 2 患者身體指標(biāo)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of body indices

通過基因型檢測(cè)，在本研究條件下，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族的 COMP 外顯子 15 中鑒定發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的變體 ( 1675 堿基-G 突變?yōu)?A，559 氨基酸-谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?)，統(tǒng)計(jì)所有受試者 COMP 基因型，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 基因突變頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 ) ( 表 3 )。

表 3 COMP 基因突變頻率與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病關(guān)系Tab.3 Relationship between COMP gene mutation frequency and knee osteoarthritis

四、WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分結(jié)果顯示，COMP 突變 A 等位基因與 COMP 正常 G 等位基因相比，WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分增加，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 ) ( 表 4 )。

表 4 WOMAC 膝骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分Tab.4 WOMAC knee osteoarthritis index

五、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者骨骼放射學(xué)檢查

本實(shí)驗(yàn)通過放射學(xué)檢查受試者骨骼，X 線片顯示，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者手很小，趾骨和掌骨短而粗，有錐形的骨骺；脊柱側(cè)凸，上下脊柱的距離變寬；脛骨和腓骨輕度縮短，膝內(nèi)翻；骨盆無線電圖顯示髖臼角增大，髖關(guān)節(jié)間隙變窄，股骨頭變平，股骨頭不規(guī)則，頸部縮短 ( 圖 2 )。

六、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族代數(shù)與發(fā)病年齡關(guān)系

COMP 基因突變和發(fā)病年齡因家庭成員而異。隨著家族代數(shù)增加，COMP 基因突變頻率增加，平均發(fā)病年齡降低，第 4 代發(fā)病年齡為 ( 39.17± 8.64 ) 歲，第 5 代發(fā)病年齡為 ( 28.36±6.43 ) 歲，第 6 代發(fā)病年齡為 ( 14.13±3.51 ) 歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 ) ( 表 5 )。

表 5 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族代數(shù)與發(fā)病年齡關(guān)系Tab.5 Relationship between family algebra and age at onset

七、血漿 COMP 和抗 CCP 抗體水平

使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè) COMP 和抗 CCP 抗體水平，與對(duì)照組相比，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 和抗 CCP 抗體水平均明顯升高，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 突變 A 等位基因 COMP 和抗 CCP 抗體水平均高于 COMP 正常 G 等位基因，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 ) ( 表 6 )。

表 6 血漿 COMP 和抗 CCP 抗體水平Tab.6 Plasma COMP and anti-CCP levels

圖 2 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者骨骼放射學(xué)檢查Fig.2 Radiographs of patients with knee osteoarthritis

討 論

COMP 基因含有 19 個(gè)外顯子，編碼 552 kDa 五聚體黏附糖蛋白，主要在軟骨，韌帶和肌腱中表 達(dá)[10]。COMP 是一種模塊蛋白，含有氨基末端結(jié)構(gòu)域，4 個(gè)表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)序列，8 個(gè)鈣調(diào)蛋白重復(fù)序列以及 1 個(gè)大的羧基末端球狀結(jié)構(gòu)域[11-12]。絕大多數(shù)先前鑒定的 COMP 突變 ( 約 95% ) 聚集在外顯子 8-14 內(nèi)，其余 5% 的突變位于外顯子 16 和 18 中[7,13]。這些包括點(diǎn)突變，其導(dǎo)致保守殘基的單氨基酸取代和刪除一個(gè)或多個(gè)殘基的密碼子的框內(nèi)缺 失[14-16]。位于染色體 19p12 上的 COMP 基因的外顯子 18 中鑒定的 c.2152 C＞T 取代導(dǎo)致 718 位的疏水性色氨酸對(duì)于帶正電荷的精氨酸的非保守取代，該突變位于 COMP 的 C 末端球狀結(jié)構(gòu)域中[17]。雖然沒有對(duì)色氨酸取代進(jìn)行功能分析，但精氨酸的 718 位置在整個(gè)物種中是保守的，包括倭黑猩猩、牛科動(dòng)物、馬、小鼠和大鼠[18]。本研究發(fā)現(xiàn) 32 個(gè)個(gè)體在 COMP 基因中攜帶 c.1675G＞ A 突變，其中 19 個(gè)受影響并顯示經(jīng)典的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病表型，13 個(gè)沒有突變，但具有膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的共同特征和放射學(xué)研究，平均發(fā)病年齡為 ( 30.26±3.68 ) 歲，可能是具有多因素遺傳的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病。外顯子 15 本課題組長(zhǎng)期隨訪篩選的關(guān)鍵突變位點(diǎn)。

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 水平均明顯升高，表明 COMP 可作為區(qū)分膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者和健康個(gè)體的有用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)志物，也可用于判斷疾病的嚴(yán)重程度。在本研究中，抗 CCP 水平也被測(cè)量，與健康對(duì)照受試者相比，OA 患者的抗 CCP 水平顯著升高，抗 CCP 水平顯示出高特異性和低敏感性，用于區(qū)分膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者和健康對(duì)照受試者。骨骼的成像特征在骨骼的骨破壞階段經(jīng)常發(fā)生變化，基于體格檢查，X 線片結(jié)果的早期診斷可能對(duì)建立治療策略沒有用。因此，骨關(guān)節(jié)功能障礙的早期評(píng)估需要具有高靈敏度和特異性的方法。在本研究中，血清 COMP 水平證明了用于區(qū)分膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者和健康對(duì)照受試者的可接受的診斷性能。COMP 水平為 21.51 ng / ml 是區(qū)分 OA 患者和健康個(gè)體的最佳臨界值。

本研究有一些局限性。首先，樣本是從當(dāng)?shù)蒯t(yī)院中選出的，這可能會(huì)對(duì)結(jié)果的推斷產(chǎn)生一些限制。因此，在推斷本研究結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮樣本的代表性。其次，研究中的患者持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，因此個(gè)體的 COMP 值可能受多種因素的影響，這可能會(huì)影響最佳的臨界值。

綜上所述，本研究表明 COMP 基因多態(tài)性與常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病緊密相關(guān)，血清 COMP 水平有可能被用作 RA 中軟骨代謝的生物學(xué)標(biāo)志物。血清 COMP 的臨界值為 21.51 ng / ml 可用于區(qū)分 RA 患者和健康個(gè)體。