β-防御素2的生物學(xué)特性及與腸道相關(guān)疾病的關(guān)系

李文龍，廖寶春，曾祥泰

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科，江西 贛州 341000）

由于人類自身不良飲食習(xí)慣及食品污染等原因，近年來腸道疾病在我國的發(fā)病率逐年升高。腸道黏膜屏障是外界環(huán)境與宿主生物體分離的動態(tài)屏障，它與腸道菌群和免疫系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)雜動態(tài)的交流，對腸道免疫功能和菌群微環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的調(diào)節(jié)作用［1］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腸道黏膜屏障的破壞是多種腸道疾病的首趨階段。因此，腸道黏膜細(xì)胞及其分泌的免疫因子的功能便成為研究及治療腸道疾病的關(guān)鍵所在。

人β-防御素（human beta-defensin，HBD）主要在皮膚和黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，具有強(qiáng)大的抗菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫活性等，是人體抵抗外界病原微生物入侵并參與人體免疫反應(yīng)的重要組成部分。目前，β-防御素包括HBD1～6［2］。德國學(xué)者HARDER J［3］在1997 年首次發(fā)現(xiàn)人的β-防御素2（human beta-defensin-2，HBD-2），主要在人的表皮細(xì)胞和黏膜細(xì)胞表達(dá)，是最早被發(fā)現(xiàn)可被誘導(dǎo)表達(dá)的β-防御素。HBD-2 在人體消化道分布廣泛，是腸道免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對腸道疾病的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用。本文對國內(nèi)外有關(guān)HBD-2 生物學(xué)特性及與腸道疾病關(guān)系的研究進(jìn)行了總結(jié)，以更加深入的了解HBD-2 對腸道疾病的作用機(jī)制，為以后的研究提供思路。

1 HBD-2的生物學(xué)特性

1.1 HBD-2 的生物結(jié)構(gòu)及組織分布HBD-2 分子包含41 個氨基酸殘基，在空間結(jié)構(gòu)上依靠3 對二硫鍵形成穩(wěn)定的1個α 螺旋和3個β 折疊，其穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)是降低致病微生物活性的關(guān)鍵。氨基酸殘基陽離子形成的表面正電荷使HBD-2 在空間結(jié)構(gòu)上形成帶電區(qū)和疏水區(qū)［4］，這種特殊結(jié)構(gòu)使HBD-2即具有親脂性又具備親水性。結(jié)構(gòu)上的“雙親性”決定了HBD-2 的抗菌活性，使其能夠破壞病原微生物的細(xì)胞膜，從而起到殺滅病菌的作用。而正常的真核細(xì)胞不具備這種結(jié)構(gòu)，因而不與HBD-2 發(fā)生作用。

HBD-2 在人體中分布廣泛，在皮膚、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、造血系統(tǒng)（骨髓、胸腺）、泌尿生殖道、血管、牙齦等組織細(xì)胞中均有分布［5］。此外，HBD-2 在人母乳中也有表達(dá)［6］。正常情況下，腸道HBD-2 主要在結(jié)腸表達(dá)，但表達(dá)水平很低，當(dāng)腸上皮被致病微生物入侵或發(fā)生炎癥時，腸黏膜細(xì)胞被誘導(dǎo)大量表達(dá)HBD-2，發(fā)揮重要的防御作用［7］。

1.2 HBD-2 的基因及表達(dá)HBD-2 基因簇定位于人第8 號染色體8p22～p23.1 區(qū)域內(nèi)。HBD-2 基因序列中包含2 個外顯子，其中外顯子1 長度較長，編碼5"端非翻譯區(qū)和信號肽區(qū)；外顯子2長度較短，編碼成熟肽和3"端非翻譯區(qū)，而前導(dǎo)肽區(qū)由二者共同編碼。原始多肽成熟后才能執(zhí)行HBD-2 的各種生物活性，經(jīng)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和酶切后，原始多肽N 端23 個氨基酸的先導(dǎo)肽被切去，進(jìn)而形成3 對二硫鍵成為成熟穩(wěn)定的HBD-2，發(fā)揮各種生物活性［8］。

HBD-2 在微生物刺激及促炎因子誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，是第一種被發(fā)現(xiàn)可呈誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽。HBD-2 被誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞表達(dá)HBD-2都需活化病原模式識別受體（PRRs）。尤其是Toll樣受體識別配體導(dǎo)致NF-κB信號通路激活，促使HBD-2 的表達(dá)的研究已相當(dāng)清楚［9］。除NF-κB 信號通路外，HBD-2 的合成還與Src-依賴的Raf-MEK1/2ERK、MAP 激 酶 等 信 號 通 路 有 關(guān)［10］。HBD-2 表達(dá)的基本途徑是：上皮細(xì)胞被病原微生物入侵或炎癥因子刺激，病原模式識別受體被活化，進(jìn)而激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子隨之與HBD-2基因啟動子相結(jié)合，HBD-2 基因隨之被激活，表達(dá)上調(diào)，HBD-2mRNA 增加［10］。但HBD-2 基因被誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究。

1.3 HDB-2 的生物活性HBD-2 具有高效、廣譜的抗菌活性。HBD-2 對革蘭陰性菌有高效的殺傷作用，10 μg·mL-1濃度的HBD-2 對綠膿桿菌、大腸桿菌等革蘭陰性菌的殺傷效果可達(dá)90%；而對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌，100 μg·mL-1濃度的HBD-2才有殺傷作用［11］。此外，HBD-2 對一些耐藥菌株同樣具有一定的抗菌作用。HBD-2 具有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)，能夠抵御病原微生物蛋白酶的水解，可有效減少抗藥菌的出現(xiàn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株的存在［12］。研究發(fā)現(xiàn)，HBD-2 融合蛋白在體外對多重耐藥幽門螺桿菌具有顯著的抗菌活性［13］。另有研究證實(shí)，HBD-2 對多重耐藥大腸埃希菌的抗菌作用隨著時間的加長而逐漸加強(qiáng)，并且與其他防御素合用時，其抗耐藥菌作用進(jìn)一步加強(qiáng)［14］。由此推測HBD-2 在體內(nèi)可能是通過與其他防御素協(xié)同而發(fā)揮抗耐藥菌作用。據(jù)報道，HBD-2 對結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv（1.5 μM）有抗菌活性，表明使用防御素對抗結(jié)核分支桿菌是有可能的［15-16］。

HBD-2對真菌有較強(qiáng)的殺滅作用。HBD-2對體外培養(yǎng)的白色念珠菌具有明顯的殺滅作用，其作用機(jī)制可能是通過磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸酯介導(dǎo)的膜通透性殺死白色念珠菌［17］。

HBD-2 對支原體、病毒有抑制作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，唾液支原體感染牙齦上皮細(xì)胞后，能誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞表達(dá)HBD-2，而HBD-2 的表達(dá)能顯著抑制唾液支原體的生長［18］。HBD-2 對病毒也有一定的殺傷作用。陳飛等［19］發(fā)現(xiàn)宮頸癌和HPV 感染患者陰道灌洗液HBD-2 的表達(dá)明顯升高，提示HBD-2 在陰道的表達(dá)有可能成為宮頸癌的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。另有研究表明，HBD-2在外陰疣及尖銳濕疣等皮膚HPV 感染中的表達(dá)也有顯著增加，由此猜測HBD-2可能有抗HPV 感染的能力［20-21］。先前的研究已證實(shí)，HBD-2 對帶狀皰疹病毒等也有一定的殺傷作用［22］。HIV/AIDS 患者血液中HBD-2 表達(dá)水平上調(diào)，可能是HIV 病毒誘導(dǎo)所致，HBD-2 可能參與了HIV/AIDS 的免疫調(diào)控過程［23］。

HBD-2 對惡性腫瘤具有抑制作用。晚期腫瘤的治療目的是為了改善患者生存質(zhì)量及延長患者生命，長期以來晚期腫瘤的治療方法主要以放療和化療為主，然而這兩種治療方法都有明顯的不良反應(yīng)，對消化系統(tǒng)和造血系統(tǒng)造成損害，進(jìn)一步打擊人的免疫系統(tǒng)。防御素抗腫瘤作用主要通過損傷腫瘤細(xì)胞骨架來實(shí)現(xiàn)，對人體正常細(xì)胞和免疫系統(tǒng)沒有損害［24］。目前普遍認(rèn)為防御素主要通過抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力而發(fā)揮抗腫瘤作用［25-26］。研究發(fā)現(xiàn)，HBD-2 在黑色素瘤細(xì)胞中，通過激活qRB、上調(diào)p21WAF1 的表達(dá)水平、下調(diào)B-Raf、CyclinD1和CyclinE 的表達(dá)水平，使黑色素瘤細(xì)胞周期阻滯在G1/S期［27］。時妍梅等［28］的研究發(fā)現(xiàn)HBD-2對TGF-β/Smad信號通路的活性有負(fù)向調(diào)控的作用，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，然而，HBD-2 的過量表達(dá)可能具有致癌作用，動物實(shí)驗(yàn)表明食管中HBD-2 的過量表達(dá)與大鼠食管鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的進(jìn)展呈正相關(guān)，表明HBD-2 可能在食管SCC的發(fā)生和發(fā)展中起著致癌作用［29］。

HBD-2 在人的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。HBD-2 在mmol·L-1主要起殺菌作用，在μmol·L-1主要起趨化活性。在天然免疫中，HBD-2 被大量誘導(dǎo)表達(dá)和釋放，發(fā)揮其趨化活性到達(dá)感染組織局部，對病原微生物造成直接的殺傷作用，同時趨化巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞到達(dá)感染部位，從而增強(qiáng)局部的防御功能［30］。NIYONSABA F等［31］研究證實(shí)HBD-2 能趨化并激活肥大細(xì)胞，使其脫顆粒，釋放前列腺素和組胺，使血管壁舒張通透性增加，有利于中性粒細(xì)胞等炎癥因子向炎癥局部移動和聚集。在獲得性免疫中，HBD-2 能趨化樹突狀細(xì)胞、記憶T細(xì)胞，激活機(jī)體獲得性免疫系統(tǒng)。據(jù)報道，低分子濃度的HBD-2 能與記憶性細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞相結(jié)合，趨化記憶性細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞朝著受致病微生物侵襲的部位遷移，從而提高機(jī)體的獲得性免疫反應(yīng)水平［32］。

2 HBD-2與腸道相關(guān)疾病的關(guān)系

在防御素與腸道疾病相關(guān)性的研究中，HBD-2是研究最為深入的防御素。研究發(fā)現(xiàn)HBD-2 和人類多種腸道疾病的關(guān)系密切。目前，HBD-2 對炎癥性腸病、腸道腫瘤和肝臟相關(guān)的腸道疾病作用的研究較為深入，但具體作用機(jī)制尚未完全清楚。

2.1 HBD-2與炎癥性腸病潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種與自身免疫相關(guān)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，與克羅恩?。–D）一起被稱為炎癥性腸病（IBD）。UC 在歐美國家發(fā)病率較高，近年來UC 在我國的發(fā)病例數(shù)也逐年增多。目前，UC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上也無特效藥，是難治性腸道疾病之一［33］。因此，對UC 病因及發(fā)病機(jī)制的研究已成為醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HBD-2 在UC患者病變結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)水平顯著升高，且HBD-2 表達(dá)的上調(diào)與HBD-2 在天然免疫和獲得性免疫中的作用有關(guān)［34-35］。同時，VORA 等［36］學(xué)者認(rèn)為HBD-2 有限制UC 炎癥反應(yīng)的作用，HBD-2 通過趨化獲得性免疫細(xì)胞在炎癥部位聚集，增強(qiáng)腸道獲得性免疫反應(yīng)，影響潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)程。另有研究表明，HBD-2 的表達(dá)水平與結(jié)腸黏膜組織炎癥程度呈正相關(guān)，但HBD-2 的表達(dá)水平與UC 患者臨床病情輕重?zé)o關(guān)［37］。

此外，HBD-2 能限制UC 炎癥反應(yīng)，同時也能使炎癥反應(yīng)不斷放大，對腸道造成損傷。陳曦等［38］研究發(fā)現(xiàn)UC 患者結(jié)腸黏膜組織中HBD-2 與TLR4 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，TLR4 通過與腸道細(xì)菌-LPS 反應(yīng)，誘導(dǎo)腸上皮HBD-2 的表達(dá)，而HBD-2 能夠趨化未成熟樹突狀細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞并與這兩種細(xì)胞結(jié)合，并通過TLR4 途徑誘導(dǎo)它們成熟，保護(hù)腸黏膜不受病原微生物入侵。由此推測TLR4 的過度表達(dá)而引起的一系列反應(yīng)可能是導(dǎo)致UC 免疫失衡的重要因素。UC 患者結(jié)腸黏膜組織中HBD-2 的過量表達(dá)可能對腸道造成進(jìn)一步損傷。有學(xué)者認(rèn)為HBD-2可能與結(jié)腸炎癥反應(yīng)持久放大有關(guān)［39］。研究表明UC結(jié)腸黏膜組織HBD-2 的表達(dá)水平與促炎因子IL-1β和TNF-α 的表達(dá)呈正相關(guān)，互為因果、互相誘生，使UC 炎癥損傷不斷加重［40］。因此，有效預(yù)防UC 患者過量表達(dá)HBD-2 對病情的恢復(fù)非常重要。已有研究證實(shí)，加味白頭翁湯、銀杏葉提取物（EGB761）、化濁解毒抑潰方等藥物可下調(diào)潰瘍性結(jié)腸炎HBD-2的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，促進(jìn)黏膜修復(fù)，而雙歧桿菌胞壁蛋白可以誘導(dǎo)人腸腺上皮細(xì)胞HBD-2 基因表達(dá)［41］。

β-防御素基因在健康人群中存在多態(tài)性，多態(tài)性改變可能導(dǎo)致防御素表達(dá)缺陷，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CD患者普遍都有HBD-2、HBD-3 的缺乏，以HBD-2 的缺乏更為顯著，由此推測HBD-2 的表達(dá)缺陷可能與CD密切相關(guān)［42］。隨著研究的深入，HBD-2將為臨床上診斷炎癥性腸病提供一個新的依據(jù)。此外，由于HBD-2 是一種內(nèi)源性多肽，利用基因工程技術(shù)大量制備，將為炎癥性腸病的治療提供新的選擇。

2.2 HBD-2 與結(jié)直腸癌近年來，結(jié)直腸癌在中國的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢，但其確切病因仍然未知。因此，深入研究結(jié)直腸癌的病因和發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而達(dá)到有效預(yù)防、早期診斷和靶向治療是一項迫切的醫(yī)學(xué)任務(wù)。目前，對防御素與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究成為學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)。有學(xué)者在結(jié)直腸癌組織中檢測到了高表達(dá)量的HBD-2，由此推測HBD-2 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，或可為結(jié)直腸癌的預(yù)測提供依據(jù)［43］。研究表明HBD-2 對結(jié)直腸癌有一定的抑制作用，HBD-2 通過趨化并激活樹突狀細(xì)胞和T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，而樹突狀細(xì)胞在局部的浸潤程度與腫瘤的進(jìn)展相聯(lián)系，其浸潤程度可通過檢測S100 蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行標(biāo)明［44］。在孫小娟等［45］的研究中，運(yùn)用免疫組化法檢測HBD-2 和S100蛋白在結(jié)直腸癌患者結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)情況，分析HBD-2 與樹突狀細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，結(jié)果表明S100 蛋白和HBD-2 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著升高，且HBD-2 在腫瘤組織中的表達(dá)與樹突狀細(xì)胞的浸潤程度呈正相關(guān)，提示HBD-2 和樹突狀細(xì)胞可能共同參與對腫瘤的免疫反應(yīng)，且樹突狀細(xì)胞浸潤程度越高，HBD-2 的表達(dá)水平就越高，對腫瘤的抵御作用也就越強(qiáng)。

2.3 HBD-2 與肝臟相關(guān)的腸道疾病肝臟和腸道具有共同的胚胎起源，兩者之間在生物學(xué)功能上聯(lián)系緊密。肝臟功能受到損傷時，由于腸道內(nèi)的細(xì)菌及內(nèi)毒素移位進(jìn)入血液循環(huán)，內(nèi)毒素隨血液循環(huán)侵入肝臟，激活肝臟的Kupffer細(xì)胞，釋放炎癥因子，對腸道黏膜屏障造成進(jìn)一步的破壞［46］。在動物實(shí)驗(yàn)中，β 防御素-2 在急性肝損傷大鼠模型小腸中表達(dá)增加，且隨著腸黏膜損傷程度的加重而升高［47］。滕麗娟［48］建立急性肝損傷小鼠模型，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測β防御素-2 mRNA在急性肝損傷小鼠模型回腸組織中的表達(dá)。結(jié)果提示造模6 h 后小鼠腸組織β 防御素-2 mRNA 開始升高，12 h 后β 防御素-2 mRNA表達(dá)量達(dá)高峰。隨著小鼠肝損傷進(jìn)一步加重，β 防御素-2 水平在早期升高，后逐漸下降，且與小鼠ALT、AST 的變化水平一致，推測可能是腸黏膜通過表達(dá)β防御素-2對抗腸源性內(nèi)毒素血癥所作出的保護(hù)性反應(yīng)。但是，人類肝損傷是否會引起腸道HBD-2表達(dá)的改變，目前缺乏相關(guān)研究。

3 小結(jié)與展望

HBD-2 具有高效的殺菌作用，且HBD-2 穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)能有效抵抗致病菌蛋白酶的水解，這為抗生素的不合理應(yīng)用而導(dǎo)致的“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)提供了新的解決思路。HBD-2 是機(jī)體固有免疫不可或缺的一員，也是聯(lián)系細(xì)胞免疫和體液免疫的重要媒介。此外，HBD-2 對腫瘤細(xì)胞有抑制作用，且對機(jī)體的毒副作用小，在晚期腫瘤的治療中具有良好的前景。HBD-2 作為腸道抵御病原微生物的重要物質(zhì)，參與了腸道黏膜屏障的構(gòu)成，為維護(hù)腸道健康發(fā)揮了重要作用。

在深入了解HBD-2 表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，設(shè)計藥物對腸道HBD-2 的表達(dá)進(jìn)行特異地調(diào)節(jié)，以此達(dá)到治療目的。深入研究HBD-2 轉(zhuǎn)基因體系，應(yīng)用基因工程構(gòu)建HBD-2 高表達(dá)系統(tǒng)，大量生產(chǎn)人源化的抗菌肽，將有助于對疾病發(fā)病機(jī)制的闡明，并為新型抗生素的開發(fā)提供理想的模板和分子骨架，給炎癥性腸病、腸道腫瘤及與肝臟相關(guān)的腸道疾病的治療帶來新的希望。此外，對腸道HBD-2 的深入研究，可能為早期診斷及治療以腸道黏膜屏障損傷為特征的腸缺血性疾病提供新的方法。