環(huán)狀RNA在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展

陸瀅雪 綜述 羅新華 審校

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使大量非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)。ncRNA參與許多疾病的病理過(guò)程。近20年來(lái)，人們鑒定出許多種類ncRNA，如長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)、miRNA(micro RNA)和circRNA[1]。circRNA于1976年被發(fā)現(xiàn)，曾被認(rèn)為是前體mRNA (pre-mRNA)錯(cuò)接的副產(chǎn)品，至今已發(fā)現(xiàn)了上萬(wàn)種。circRNA主要由外顯子或內(nèi)含子序列產(chǎn)生，反向互補(bǔ)序列或RNA結(jié)合蛋白(RBPs)是環(huán)狀RNA生物發(fā)生的必要條件。最近的報(bào)道[2]顯示，circRNA可以作為microRNA (miRNA)海綿來(lái)保護(hù)mRNA的翻譯，通過(guò)剪接和轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)影響親代基因的表達(dá)，或者與蛋白質(zhì)相互作用來(lái)影響其功能。有證據(jù)[3]表明，circRNA參與了HCC的發(fā)生，并在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。circRNA可作為一種潛在的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，而circRNA在HCC中的潛在機(jī)制目前尚不清楚。

1 circRNA 的形成

circRNA 主要有3種類型：外顯子來(lái)源的circRNA(ecircRNA)、內(nèi)含子來(lái)源的circRNA(ciRNA)、外顯子—內(nèi)含子circRNA。目前發(fā)現(xiàn)的circRNA，80%為ecircRNA。ecircRNA的形成機(jī)制主要有兩種途徑：套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化。ciRNA主要通過(guò)自我剪接內(nèi)含子形成。EIciRNA的形成機(jī)制目前尚未研究清楚。

2 circRNA的分子特征

(1)circRNA廣泛存在于真核生物體的不同組織，如睪丸、大腦、胃、乳腺和前列腺等，多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞核，非常穩(wěn)定，不易被核酸外切酶RNaseR降解。(2)circRNA序列高度保守，具有細(xì)胞、組織類型特異性和階段特異性。(3)大多數(shù)circRNA由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子組成，少數(shù)由內(nèi)含子或內(nèi)含子片段直接環(huán)化形成。(4)作為miRNA海綿競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，使miRNA失去其自身功能及對(duì)下游靶基因的調(diào)節(jié)功能。(5)多數(shù)circRNA在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用，少數(shù)只能在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控作用。(6)與蛋白質(zhì)相互作用，miRNA效應(yīng)器可以與circRNA結(jié)合而被降解。同時(shí)，circRNA通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過(guò)程。(7)參與蛋白質(zhì)翻譯，大多數(shù)circRNA為ecircRNA，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，因此，可以裝載至核糖體中，并翻譯成多肽。

3 circRNA的功能

一些具有相同miRNA應(yīng)答元件的RNA可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA位點(diǎn)來(lái)影響miRNA對(duì)其靶基因的作用，從而影響腫瘤的生物學(xué)行為，稱為miRNA的“海綿作用”(miRNA sponge)。circRNA也能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA位點(diǎn)，影響miRNA及下游靶基因的表達(dá)。circRNA通過(guò)應(yīng)答元件與miRNA相互關(guān)聯(lián)后，既可以作為腫瘤抑制因子，又可以作為一種原癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNAs)包含mRNA、假基因轉(zhuǎn)錄物、lncRNAs和circRNA ，可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA。因此，ceRNAs的存在或缺失會(huì)影響miRNAs對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。如果ceRNA基因表達(dá)出現(xiàn)失調(diào)，就可能發(fā)生疾病。

4 HCC中的circRNA

HCC惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，對(duì)多種化療藥物耐藥，預(yù)后差。HCC通常通過(guò)血液或淋巴轉(zhuǎn)移，只要發(fā)生轉(zhuǎn)移就很難控制[4]。然而，HCC缺乏有效的臨床預(yù)測(cè)、診斷和治療方法，促使科學(xué)家尋找更好的腫瘤標(biāo)志物。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)ncRNA尤其是環(huán)狀RNA的失衡表達(dá)在HCC中更為常見(jiàn)，與疾病的發(fā)展密切相關(guān)。這一現(xiàn)象表明，科學(xué)家可能能夠在circRNA領(lǐng)域闡明HCC的發(fā)病機(jī)制，找到HCC的治療靶點(diǎn)。

5 作為HCC的抑制劑或促進(jìn)劑

circRNA具有大量的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)有助于circRNA與miRNA相互作用[5]。研究[6]證明circRNA可以通過(guò)與miRNA相互作用調(diào)控親本基因的表達(dá)。has_circ_0005075可能與四種miRNA相互作用，包括hsa-miR-23b-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-581和hsa-miR-23 a-5p，從而抑制這些miRNA的表達(dá)和功能，提示HCC中has_circ_0005075的高表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，has_circ_0005075可能作為一種新的HCC生物標(biāo)志物[7]。

從circRNA芯片分析中篩選出的circ_100338的上調(diào)與肝癌合并HBV感染患者的累積低生存率密切相關(guān),且與肝癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展呈正相關(guān)。circ_100338作為miR-141-3p的海綿,可被miR-141-3p拮抗,抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)展。miR-141-3p過(guò)表達(dá)對(duì)侵襲能力的抑制可通過(guò)miR-141-3p和circ-100338在MHCC97H細(xì)胞中共表達(dá)來(lái)恢復(fù)。同樣，circ_100338誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)也可以通過(guò)miR-141-3p上調(diào)來(lái)挽救。這些結(jié)果表明，circ_100338作為一種新的生物標(biāo)志物，在HBV相關(guān)的HCC患者的診斷和患者生存評(píng)估中具有潛在價(jià)值。

多種信號(hào)通路已被報(bào)道參與HCC的病理機(jī)制。FZD5據(jù)報(bào)道為受體和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的催化劑。hsa_circ_0067934可以通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路吸附mir-1324海綿，使其在HCC中表達(dá)上調(diào)。miR-1324可以靶向FZD5的3′-UTR 損害 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。敲低circ-0067934或miR-1324過(guò)表達(dá)既能下調(diào)FZD5表達(dá)和抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活,顯著抑制肝癌細(xì)胞系Hep3B和HuH7細(xì)胞增殖、遷移和入侵。結(jié)果表明,circ_0067934/miR-1324/FZD5/Wnt/β-catenin信號(hào)軸可能作為一種很有前途的HCC干預(yù)的目標(biāo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p靶點(diǎn)hsa_circ_0005986明顯低于正常組織[8]。hsa_circ_0005986低表達(dá)水平與慢性乙型肝炎家族史、腫瘤直徑、微血管浸潤(rùn)和BCLC階段有關(guān)，而實(shí)驗(yàn)顯示hsa_circ_0005986釋放miR-129-5p下調(diào)和減少Notch1-mRNA的表達(dá)水平相關(guān)。有趣的是，hsa_circ_0005986的下調(diào)通過(guò)促進(jìn)G0/G1向S期轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。前期實(shí)驗(yàn)提示，這種轉(zhuǎn)變受到G0/G1調(diào)節(jié)基因2(G0S2)的調(diào)控，G0S2可能是通過(guò)激活HCC細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子PPARα，是脂肪酸在肝臟分解代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[9]，因此hsa_circ_0005986通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，參與肝癌HCC進(jìn)展。

有研究[10-11]分析了人類環(huán)狀RNA在HCC組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在HCC組織中顯著下調(diào)的circRNA:circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135),可以作為致癌miR-9的海綿，與HCC患者預(yù)后不良密切相關(guān)。在細(xì)胞質(zhì)中，circMTO1結(jié)合miR-9可以上調(diào)p21的表達(dá)，抑制HCC的進(jìn)展。p21已被確定為miR-9的腫瘤抑制因子[12]。敲低circMTO1可促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，減少細(xì)胞凋亡，降低p21 mRNA和蛋白表達(dá)，而過(guò)表達(dá)circMTO1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，上調(diào)p21的mRNA和蛋白表達(dá)。此外，miR-9過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響與circMTO1沉默類似。通過(guò)對(duì)miR-9在cric MTO1沉默細(xì)胞中的抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-9抑制劑可以抑制circMTO1敲低在HCC細(xì)胞中的促進(jìn)作用，證明circ MTO1可以通過(guò)circ MTO1/miR-9/p21軸，海綿化miR-9，抑制miR-9致癌作用。此外，circ MTO1的下調(diào)抑制了p21和下游CDK2的表達(dá)，而侵襲和增殖標(biāo)志物MMP2和PCNA在體內(nèi)上調(diào)，說(shuō)明circ MTO1在體內(nèi)和體外均能抑制HCC的進(jìn)展[13]。因此，circ MTO1有可能成為肝癌的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。另一項(xiàng)研究[13]分析顯示，從SMYD4轉(zhuǎn)錄而來(lái)的hsa_circ_0004018的下調(diào)的環(huán)狀RNA與血清AFP水平、腫瘤直徑、分化程度、BCLC分期和TNM分期相關(guān)。結(jié)果表明，hsa-circ-0004018具有一個(gè)HCC階段的特異表達(dá)。SMYD4被報(bào)道為一種潛在的腫瘤抑制因子，參與了腫瘤發(fā)生[14]，提示hsa_circ_0004018作為SMYD4的轉(zhuǎn)錄本可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展。此外，hsa_circ_0004018的敏感性優(yōu)于AFP，這意味著hsa_circ_0004018可能在HCC監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，hsa_circ_0004018含有5個(gè)miRNA序列，可能通過(guò)與miR-30e-5p/miR-626-MYC相互作用而在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

由于DExH-Box解旋酶9(DHX9)的調(diào)節(jié)，HCC組織中cSMARCA5(hsa_circ_0001445)表達(dá)下調(diào)，而SMARCA5 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)[15]。沉默DHX9可以上調(diào)cSMARCA5的表達(dá)，說(shuō)明circRNA的調(diào)控依賴于DHX9的解旋酶活性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，cSMARCA5可能通過(guò)DHX9-cSMARCA5-miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3途徑抑制肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌作用;而其親本基因SMARCA5可能是腫瘤啟動(dòng)子[15]，提示SMARCA5和cSMARCA5水平可能共同作為HCC的生物標(biāo)志物。

肝脂肪變性參與了HCC疾病的進(jìn)展。circRNA-0046367是從ncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出來(lái)的circRNA，作為miR-34a的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，在誘導(dǎo)的脂肪變性HCC細(xì)胞中顯著降低。對(duì)這些下調(diào)的circRNA-0046367失去抑制miR-34/PPARα交互,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,從而降低肝脂肪變性。配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子和PPARα是一個(gè)基礎(chǔ)脂肪酸代謝。PPARα的下調(diào)將減少PPARα介導(dǎo)脂類代謝,導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，表明circRNA0046367/miR-34a PPARα軸可能參與脂肪氧化和減少肝脂肪變性誘導(dǎo)HCC。此外，在circRNA-0046366中也觀察到同樣的結(jié)果。

通過(guò)分析circRNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，篩選出circ C3P1作為HCC中下調(diào)最明顯的環(huán)狀RNA之一。通過(guò)對(duì)臨床資料的分析，circ C3P1的表達(dá)與TNM分期、腫瘤大小、血管浸潤(rùn)程度呈負(fù)相關(guān)，分析也表明，circ C3P1表達(dá)越高，肝癌患者的生存率越低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circ C3P1在體內(nèi)和體外過(guò)表達(dá)均能顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，說(shuō)明circ C3P1可作為肝癌的抑癌因子。此外，circ C3P1可以促進(jìn)糖異生的關(guān)鍵酶PCK1在HCC中下調(diào)，而在HCC中通過(guò)海綿作用miR-4641降低PCK1可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。通過(guò)沉默PCK1，可以消除circC3P1過(guò)表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞的抑制。這些結(jié)果表明，circ C3P1/miR-4641/PCK1軸可以調(diào)節(jié)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并作為肝癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

has_circ_0001649在HCC組織中發(fā)現(xiàn)明顯下調(diào)。沉默has_circ_0001649可導(dǎo)致MMP9、MMP10、MMP13的降低，從而增加HCC的轉(zhuǎn)移，說(shuō)明has_circ_0001649的下調(diào)與HCC的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)呈正相關(guān)。進(jìn)一步分析表明，has_circ_0001649與HCC預(yù)后不良有關(guān)，可能作為HCC的生物標(biāo)志物。序列分析顯示，has_circ_0001649可能存在海綿吸附或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的潛力，含有一個(gè)U2輔助因子(U2AF)結(jié)合位點(diǎn)、五個(gè)真核起始因子4A-III (EIF4A3)結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)轉(zhuǎn)錄本(UPF1)結(jié)合位點(diǎn)參與HCC的發(fā)生發(fā)展。此外，通過(guò)生物信息學(xué)分析，has_circ_0001649也被認(rèn)為是miRNA海綿。

circ-ITCH通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制癌癥擴(kuò)散，circ-ITCH在HCC組織中的表達(dá)低于癌旁組織，circ-ITCH的高表達(dá)與HCC良好的生存率相關(guān)[16]。進(jìn)一步分析表明，circ-ITCH中rs10485505和rs4911154兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)與HCC風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。這些結(jié)果表明circ-ITCH可能具有抑制HCC的作用[16]。

ZKSCAN1是一種鋅家族基因，在多種癌癥中上調(diào)并與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。ZKSCAN1的第2外顯子和第3外顯子拼接在一起形成了circZKSCAN1的環(huán)狀RNA (hsa_circ_0001727)，在人肝臟中含量豐富。HCC中ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1均明顯下調(diào)。ZKSCAN1 mRNA的下調(diào)與腫瘤大小有關(guān)，而circ ZKSCAN1水平影響腫瘤數(shù)量、肝硬化、微血管浸潤(rùn)及腫瘤分級(jí)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，沉默或過(guò)表達(dá)RNA分別在體內(nèi)和體外增強(qiáng)或抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。上述實(shí)驗(yàn)中未觀察到相互干擾，這意味著這兩種同源的RNA在HCC中可能具有不同的調(diào)控特征。RNA-seq支持ZKSCAN1 mRNA調(diào)控細(xì)胞代謝和circ ZKSCAN1參與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的假說(shuō)[17]。因此，ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1可能通過(guò)相互作用抑制HCC的代謝、凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮HCC抑制劑的作用。

有趣的是,許多作為miRNA海綿的環(huán)狀RNA也可以被認(rèn)為是HCC的抑癌因子，如cSMARCA5、circ MTO1、circ C3P1，而有些環(huán)狀RNA可以作為腫瘤啟動(dòng)子，如has_circ_0005075、circ_100338[24(90)]等。這說(shuō)明環(huán)狀RNA在HCC中的作用機(jī)制是復(fù)雜的。circRNA可以作為腫瘤抑制因子或啟動(dòng)子，與或不與海綿miRNA結(jié)合，參與蛋白質(zhì)的結(jié)合，這表明，一個(gè)circRNA可能通過(guò)不同的途徑影響不同的HCC進(jìn)展，這意味著circRNA有可能成為HCC的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

6 小結(jié)與展望

隨著研究的推進(jìn)，circRNA的功能不斷被揭示，從錯(cuò)誤剪接的副產(chǎn)品到具有重要生物學(xué)功能的小分子。與其他ncRNA一樣，許多環(huán)狀RNA被證實(shí)參與了HCC的進(jìn)展。在這篇綜述中，我們證明circRNA是一種豐富、穩(wěn)定、保守、結(jié)構(gòu)多樣的ncRNA，在疾病尤其是HCC的調(diào)控、預(yù)測(cè)、診斷和治療靶點(diǎn)方面具有巨大的潛力。然而，由于circRNA復(fù)雜的作用機(jī)制，目前我們還不能很清楚的解釋circRNA是如何參與HCC的發(fā)展的。重要的是，circRNA在細(xì)胞中的作用和作用方式也有待發(fā)現(xiàn)。此外，circRNA結(jié)構(gòu)的特殊性和技術(shù)的不足限制了對(duì)circRNA功能的研究[18]。目前，HCC中大多數(shù)已鑒定的環(huán)狀RNA功能為miRNA海綿和/或癌抑制因子或啟動(dòng)子。有研究報(bào)道circRNA可以通過(guò)直接與關(guān)鍵蛋白結(jié)合來(lái)調(diào)控癌癥的發(fā)展。且有轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)或多肽參與癌癥進(jìn)展的潛力。ciRNA和EIciRNA可以與聚合酶II和U1snRNP相互作用，調(diào)節(jié)其親本基因的轉(zhuǎn)錄。因此，circRNA是否在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平參與HCC的過(guò)程，或是否通過(guò)直接翻譯成蛋白發(fā)揮作用仍是一個(gè)謎。如果是，circRNA是如何參與這些過(guò)程的?如果沒(méi)有，circRNA是否有其他途徑影響HCC?

一項(xiàng)新的研究[19]表明，除了細(xì)胞外，外泌體、血液和唾液中也發(fā)現(xiàn)了豐富的環(huán)狀RNA。此外，血清外泌體—環(huán)狀RNA可能能夠區(qū)分癌癥患者和健康個(gè)體，這表明環(huán)狀RNA可能作為癌癥診斷的循環(huán)生物標(biāo)志物。由于外泌體由所有細(xì)胞分泌并在血液中循環(huán)，circRNA可能會(huì)影響外泌體運(yùn)輸遠(yuǎn)端細(xì)胞的方式。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miRNA miR-103可影響肝癌轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)血管完整性[20]。作為ncRNA的一員，穩(wěn)定的環(huán)狀RNA通過(guò)分泌進(jìn)入血液循環(huán)的方式影響肝癌的進(jìn)展，在潛在的癌癥檢測(cè)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，或者直接與癌相關(guān)基因相互作用，調(diào)控肝癌的關(guān)鍵基因，但目前機(jī)制尚不清楚。

因此，環(huán)狀RNA可能參與疾病發(fā)展、組織發(fā)育和基因調(diào)控，其中一些環(huán)狀RNA在致癌過(guò)程中發(fā)揮重要作用[21]。然而，通過(guò)少量的整合研究，我們只能得出circRNA參與HCC發(fā)展的結(jié)論，而不能得出circRNA在HCC發(fā)展過(guò)程中必須發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)論?？梢钥隙ǖ氖?，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷推進(jìn)，如RNA測(cè)序?qū)cRNA]等實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，circRNA在HCC發(fā)展中的作用將逐漸顯現(xiàn)。因此，開(kāi)發(fā)和使用合適的技術(shù)來(lái)闡明環(huán)狀RNA在HCC中的分子機(jī)制及其調(diào)控機(jī)制將是未來(lái)研究的重點(diǎn)。