植酸酶及其應(yīng)用前景(綜述)(續(xù)1)

張相鑫 譯自，Vol.54(2018)，№4：352～360

唐彩琰 校

2 植酸酶的特性

植酸酶屬于磷酸酶類(EC 3.1.3.)，可催化植酸鹽水解去除無機磷酸鹽。這些酶主要來自植物、細(xì)菌和真菌。許多種類的細(xì)菌和真菌含有3-植酸酶(EC 3.1.3.8)，該酶從植酸第3個碳原子上的磷酸基團開始水解。植物和大腸埃希菌均可表達(dá)6-植酸酶(EC 3.1.3.26)，其首先水解第6個碳原子上的化學(xué)鍵。3-植酸酶水解的終產(chǎn)物是L-肌醇-2-磷酸酯，而6-植酸酶可使底物完全去磷酸化。此外，研究人員也鑒定出了5-植酸酶(EC 3.1.3.72)，該酶從第5個碳原子處啟動磷酸分解反應(yīng)。研究表明，酪氨酸磷酸酶(PTPLP)也具有植酸酶活性，可以使用肌醇多磷酸鹽作為底物。肌醇多磷酸鹽的水解從肌醇的第3個或第4個碳原子開始，形成磷酸鹽和肌醇-1,2-二磷酸。

根據(jù)結(jié)構(gòu)和催化植酸磷酸鹽分解機制的不同，植酸酶可被分為組氨酸酸性磷酸酶(Histidine Acidic Phosphatases，HAPs)、β-螺旋植酸酶 (β-Propelleric Phytases，BPPs)、紫色酸性磷酸酶(Purple Acidic Phosphatases，PAPs)和具有植酸酶活性的酪氨酸磷酸酶。

HAPs含有保守的組氨酸氮端(N-)和碳端(C-)。在催化過程中，酶的N-端和C-端彼此靠近形成催化中心，磷酸的兩步分解發(fā)生在該催化中心。大多數(shù)細(xì)菌和部分真菌如枝孢菌屬(Cladosporium sp.)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、泡盛曲霉菌(Aspergillus awamori)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)能夠分泌HAPs。曲霉屬(Aspergillius sp.)的植酸酶被廣泛用作豬和家禽的飼料添加劑。HAPs在酸性介質(zhì)(最適pH為4.5～6.0)中具有活性。在此條件下，植酸鹽失去金屬離子成為植酸，植酸與植酸酶帶正電荷的催化中心親和。用螯合劑去除金屬離子可提高植酸酶的活性。HAPs可非特異性水解磷酯，如ATP、AMP、果糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸和對硝基苯酚磷酸鹽等。并非所有的HAPs都有植酸酶活性。

BPPs(EC 3.1.3.8)廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動物中。該植酸酶因具有特殊的空間結(jié)構(gòu)而得名，它們擁有一種類似六葉螺旋槳的結(jié)構(gòu)。BPPs還包括一些堿性植酸酶，這些酶在pH大于7時水解植酸。堿性植酸酶最先在地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中被鑒定出。植物[如寬葉香蒲(Typha latifolia)和百合(Lilium longixorum)等]的花粉中也發(fā)現(xiàn)了堿性BPPs。研究人員在土壤細(xì)菌如淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和左乳酸芽孢桿菌(Bacillus laevolacticus)中發(fā)現(xiàn)了胞外堿性植酸酶。堿性植酸酶的X射線結(jié)構(gòu)分析不僅顯示了它們的特殊結(jié)構(gòu)，還顯示了兩個磷酸基團和六個鈣離子可能結(jié)合的氨基酸形成位點。鈣離子在這個反應(yīng)中作為輔助因子。

顯然，植酸酶可參與微生物的某些生理反應(yīng)。BPPs敲除的枯草芽孢桿菌菌株的生長效率降低，尤其是在pH、溫度和鹽濃度未達(dá)到最適水平的情況下。

細(xì)菌、真菌和動物均能分泌PAPs，其中以植物的最為廣泛。PAPs因呈現(xiàn)粉紅色或紫色而得名，這是由于它們的催化中心含有Fe3+，其他金屬離子還有鋅(也參與催化)、二價鐵和錳。該PAPs主要結(jié)構(gòu)還包括參與金屬螯合的保守性氨基酸序列。植物基因組含有許多被鑒定為PAPs編碼基因的基因。然而，并不是所有的PAPs都具有植酸酶活性。這表明這些植酸酶不僅參與磷酸鹽、肌醇和金屬離子的代謝，還具有一些其他功能。試驗表明，PAPs參與植物抵抗熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激和鹽化應(yīng)激等過程，還具有過氧化物酶活性。

PTPLPs也被稱為半胱氨酸植酸酶，其活性中心擁有CX5R(S/T)結(jié)構(gòu)域，它需要結(jié)合參與水解的磷酸。PTPLPs不能識別酪氨酸磷酸酶的特有底物。該酶最早從反芻動物瘤胃中的反芻獸月形單胞菌和埃氏巨型球菌中分離得到。從δ-變形桿菌噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)分離的PTPLP對肌醇六磷酸酯具有高度特異性。

3 植酸酶活性的檢測方法

植酸酶活性既可以利用微生物學(xué)方法測定，也可以利用化學(xué)方法測定。前一種方法基于微生物能在以植酸為唯一磷源的培養(yǎng)基中生長；化學(xué)方法則根據(jù)最終反應(yīng)產(chǎn)物的濃度測量，即無機磷酸鹽或磷酸肌醇衍生物的濃度。微生物學(xué)方法可以篩查細(xì)菌和真菌是否具有植酸酶活性。但是，這些方法比較耗時，且只能提供植酸酶活性的粗略值。因此還需要利用其他方法來估算其活性，并揭示反應(yīng)機制。

目前廣泛應(yīng)用的測定無機磷酸鹽(inorganic Phosphate，Pi)濃度的分光光度法基于Fiske和Subbarow在1925年提出的方法。在該方法中，反應(yīng)產(chǎn)物(Pi)在酸性介質(zhì)中與鉬酸銨相互作用，形成可吸收355 nm波長光的黃色鉬酸。一些改進(jìn)方法將鉬酸進(jìn)一步還原為鉬藍(lán)，其濃度可用分光光度法(波長700 nm)測量。該反應(yīng)會用多種化合物作為還原劑，包括1-氨基-2-萘酚-4-磺酸、硫酸鐵、抗壞血酸和氯化錫。高效離子色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)無需更改就可用于估算無機磷酸鹽濃度?；跓o機磷酸鹽形成來估算植酸酶活性的方法有一個重大缺點，即研究樣品中存在其他磷酸酶，隨著含磷酸鹽化合物水解的增多，機體無機磷酸鹽儲備可能增加。因此，研究人員已經(jīng)開發(fā)出一種高靈敏度方法，用于估算產(chǎn)物色譜分離后的植酸酶活性，并利用肌醇脫氫酶定量測定肌醇的水平。

利用HPLC可以對底物水解過程中產(chǎn)生的磷酸肌醇衍生物進(jìn)行鑒定，還可以確定植酸分子中磷酸鹽開始水解的位置，同時追溯整個水解過程，并明確其最終產(chǎn)物的特征?；诟咝б合嗌V法提出的方法是為了分析磷酸肌醇衍生物[40]。

研究人員以植酸-溶菌酶復(fù)合物為底物，開發(fā)出了一種可以快速估算堿性BPPs和HAPs包括3-植酸酶和6-植酸酶活性的方法。

(未完待續(xù))