基于系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)技術(shù)的冠心病中醫(yī)藥研究思路*

王天嬌 呂曉東

系統(tǒng)生物學(xué)是從整體水平出發(fā)研究生物體的組成成分以及各組分之間的相互作用關(guān)系，以整體性研究為特征，定量闡明和預(yù)測生物功能、表型和行為的系統(tǒng)科學(xué)，其組學(xué)技術(shù)平臺包括蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、表型組學(xué)與相互作用組學(xué)等，其核心特征為多變量的整合[1-3]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是指由于冠狀動脈血管發(fā)生粥樣硬化病變致使動脈管腔狹窄、痙攣或閉塞，影響冠狀動脈血流供應(yīng)，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病，簡稱冠心病(coronary heart disease, CHD)，是動脈粥樣硬化病理改變導(dǎo)致器官病變的最常見類型[4]。CHD患者生活質(zhì)量急劇降低，病死率逐年增高，嚴(yán)重威脅人類健康，防治形勢十分嚴(yán)峻。目前有關(guān)CHD中醫(yī)藥防治的研究已取得一定成果。為了適應(yīng)治療現(xiàn)狀，中醫(yī)藥對CHD的研究亦應(yīng)與時俱進(jìn)，將系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)技術(shù)運(yùn)用到CHD的中醫(yī)藥防治中，運(yùn)用基于系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)技術(shù)打開中醫(yī)藥防治CHD作用模式研究的新途徑，為中醫(yī)藥防治CHD的新藥研發(fā)、品種改造、作用機(jī)制闡明提供理論支持。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)在CHD中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

目前中醫(yī)藥防治CHD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中于中醫(yī)證候?qū)W規(guī)律和中藥藥效學(xué)機(jī)制研究。蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞、組織或生物體的蛋白質(zhì)組為研究對象，通過蛋白質(zhì)鑒定、功能分析、翻譯后修飾等技術(shù)手段動態(tài)觀察蛋白質(zhì)表達(dá)特征以及蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，研究技術(shù)平臺主要包括功能蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、比較蛋白質(zhì)組學(xué)4個方面[5]。朱明丹等[6]利用蛋白組學(xué)技術(shù)對CHD 4個主要證型(心氣虛弱、心腎陰虛、痰濁內(nèi)阻、心血瘀阻) 進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)差異蛋白包括凝血酶原、血紅素結(jié)合蛋白、抗凝血酶Ⅲ、α2巨球蛋白、膜聯(lián)蛋白A5、血纖維蛋白溶酶原、血漿激肽釋放酶、激肽酶1、補(bǔ)體C1q、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4-A、補(bǔ)體C7、甘露糖結(jié)合蛋白C、補(bǔ)體因子H亞型1、載脂蛋白A1、載脂蛋白A4前體、載脂蛋白D、載脂蛋白E、載脂蛋白H、活化T細(xì)胞核因子5亞型b、維生素D結(jié)合蛋白，主要涉及凝血系統(tǒng)、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)、脂代謝系統(tǒng)、Wnt途徑、凋亡系統(tǒng)。劉如秀等[7]采用蛋白組學(xué)技術(shù)研究滋腎活血方對CHD腎虛血瘀型大鼠缺血心肌蛋白表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示，滋腎活血方在一定程度上可調(diào)節(jié)大鼠心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)變化，其作用靶點蛋白質(zhì)為ATP合酶α亞基、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-2、肌凝蛋白-6、乳酸脫氫酶B鏈、異檸檬酸脫氫酶，其干預(yù)機(jī)制與改善能量代謝、保護(hù)細(xì)胞骨架等功能相關(guān)。李金根[8]利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對清心解瘀方防治穩(wěn)定性CHD的作用機(jī)制進(jìn)行分析，結(jié)果顯示清心解瘀方防治穩(wěn)定性CHD的蛋白質(zhì)圖譜差異性表達(dá)中共鑒定得到20個差異蛋白，其中4個清心解瘀方防治穩(wěn)定性CHD的差異蛋白表達(dá)升高：CASP8和FADD樣凋亡調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白A-Ⅳ、神經(jīng)粘附分子CHL1；16個清心解瘀方防治穩(wěn)定性CHD的差異蛋白表達(dá)降低：補(bǔ)體因子B、載脂蛋白B、補(bǔ)體C1s亞成分、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型1、木糖基轉(zhuǎn)移酶2、生長激素受體、蛋白輕鏈、含有EH結(jié)構(gòu)域蛋白3、補(bǔ)體C4-A、反式高爾基網(wǎng)絡(luò)整合膜蛋白2、中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白23、補(bǔ)體C2、角蛋白6B、角蛋白16、角蛋白A。

系統(tǒng)生物學(xué)認(rèn)為，疾病發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)即為蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)動態(tài)平衡的擾動，而中醫(yī)證候?qū)W規(guī)律和中藥藥效學(xué)機(jī)制研究印證的正是蛋白質(zhì)被擾動之后的特異性變化，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，將為闡釋CHD中醫(yī)證候?qū)W規(guī)律和中藥藥效學(xué)機(jī)制研究的本質(zhì)和科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)，亦為CHD中醫(yī)診斷的客觀化提供方法[9]。

2 代謝組學(xué)在CHD中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

目前，代謝組學(xué)在CHD的中醫(yī)藥研究主要集中于內(nèi)源性代謝組分含量的變化，以全面研究CHD發(fā)生機(jī)制和藥物干預(yù)機(jī)制，以期找到治療CHD有效的生物標(biāo)志物指導(dǎo)臨床診斷。代謝組學(xué)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的下游研究，是通過分析生物體新陳代謝過程中代謝產(chǎn)物圖譜特征差異及其動態(tài)變化，研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)手段[10]。代謝組學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用于分子量小于1000的小分子代謝物，通過測定生物體液(如尿液、唾液、血液)、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞提取物和肝、肺、腎、腦等組織或者組織提取液中的內(nèi)源性代謝物組信息以從整體上全面分析疾病對生物系統(tǒng)的影響。史琦等[11,12]利用代謝組學(xué)技術(shù)對CHD血瘀證、氣虛證患者血漿中的內(nèi)源性小分子及大分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面鑒定，特征性代謝物篩選結(jié)果顯示，CHD血瘀證包括丙酮和纈氨酸，提示其異常代謝過程主要包括脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝；CHD氣虛證包括纈氨酸、肉堿、乙酰谷氨酸與賴氨酸，提示其異常代謝過程包括能量代謝、氨基酸代謝、糖代謝、脂肪代謝、凝血過程等多種代謝過程。鄭景輝等[13-16]采用QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測CHD心血瘀阻證的血漿代謝產(chǎn)物及尿液代謝產(chǎn)物，結(jié)果顯示，血漿代謝產(chǎn)物譜包括花生四烯酸、β-羥基丁酸、硬脂酸、葡萄糖、乳酸、檸檬酸、丙氨酸、尿素、油酸；尿液生物代謝產(chǎn)物譜包括馬尿酸、甘油、丙酮、木糖醇、葡萄糖、油酸酰胺；對血漿代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)分析，結(jié)果顯示血漿生物代謝產(chǎn)物譜共參與15條代謝路徑(丙酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和糖異生、氨基糖和核苷酸的糖代謝、嘧啶代謝、嘌呤代謝、脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝、氰基氨基酸代謝、檸檬酸循環(huán)、丙酮酸代謝、半乳糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝)，其中脂肪酸生物合成、丙酸代謝、糖酵解和糖異生通路參與其病理過程；對尿液代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)分析，結(jié)果顯示尿液生物代謝產(chǎn)物譜共參與10條代謝路徑(半乳糖代謝、戊糖和糖醛酸的相互轉(zhuǎn)換、磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解或糖異生、苯丙氨酸代謝、酮體的生成和降解、丙酸酯的代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、甘油酯代謝)，其中半乳糖代謝、酮體的合成和降解通路參與其病理過程。

另外，CHD的中醫(yī)藥治療主要以中藥復(fù)方為主，臨床應(yīng)用于CHD治療的中藥復(fù)方藥味數(shù)量從數(shù)種到數(shù)十種之間不等，有效活性成分更是繁雜多樣，潛在作用機(jī)制亦是錯綜復(fù)雜，代謝組學(xué)技術(shù)可從治療CHD中藥復(fù)方的代謝產(chǎn)物成分和含量變化差異規(guī)律中尋找出與治療CHD中藥復(fù)方相關(guān)的有效的生物標(biāo)志物及活性成分，并通過進(jìn)一步實驗驗證以探明其潛在作用機(jī)制，從而豐富中醫(yī)藥防治CHD理論內(nèi)涵，為中醫(yī)藥防治CHD提供可靠的物質(zhì)基礎(chǔ)。張開泰等[17]對CHD心血瘀阻證患者予新血府逐瘀湯進(jìn)行治療，運(yùn)用1H-NMR技術(shù)檢測CHD心血瘀阻證患者治療前后血漿小分子代謝產(chǎn)物水平，結(jié)果顯示，新血府逐瘀湯治療后，極低密度脂蛋白、丙氨酸、乳酸、葡萄糖、組氨酸的含量明顯下調(diào)，亮氨酸、蘇氨酸、檸檬酸的含量明顯上調(diào)，說明新血府逐瘀湯可能通過調(diào)整糖類、脂肪、氨基酸等物質(zhì)的代謝，從而發(fā)揮整體治療作用。魏巖等[18]對CHD先天伏寒證患者予伏寒顆粒進(jìn)行治療，利用1H-NMR檢測CHD先天伏寒證患者血清代謝標(biāo)記物，結(jié)果顯示，伏寒顆粒對脂類化合物、谷氨酸、高密度脂蛋白、β-葡萄糖、乳酸、極低密度脂蛋白、谷氨酰胺、低密度脂蛋白、α-葡萄糖等物質(zhì)含量改善明顯，說明伏寒顆?？杉m正修復(fù)CHD先天伏寒證患者的糖脂代謝紊亂與能量代謝紊亂情況。

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在CHD中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在CHD的中醫(yī)藥研究主要集中于對CHD中醫(yī)證候、中藥方劑等方面的研究。目前中醫(yī)藥應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究CHD的中醫(yī)證候?qū)W特點、中藥方劑潛在作用機(jī)制的報道尚有不足，隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)不斷完善，日后亦必將廣泛地應(yīng)用于CHD的中醫(yī)證候?qū)W特點、中藥方劑潛在作用機(jī)制中，具有良好的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)功能、組成表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，以期從RNA水平實現(xiàn)對生物和細(xì)胞功能的全部情況的解析[19]。疾病的發(fā)生進(jìn)展過程中以及在藥物干預(yù)治療的過程中會出現(xiàn)多種mRNA表達(dá)水平差異的改變，轉(zhuǎn)錄組學(xué)正是用DNA表達(dá)譜芯片測定mRNA的種類和豐度，在mRNA水平研究基因表達(dá)譜特征模式[20]。microRNA將會成為CHD一個新的診斷和治療靶點[21]。陳光等[22，23]為篩選并驗證CHD血瘀證差異基因，運(yùn)用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、斑點雜交法明確了CHD血瘀證mRNA層面的潛在生物標(biāo)志物為SLAMF1、CBARA1、ZNF350；運(yùn)用高通量芯片技術(shù)篩選差異基因明確了CHD血瘀證miRNA-mRNA層面的潛在生物志物為miR-146b-5p、miR-199a-5p、CALR、TP53，亦明確了CHD血瘀證lncRNA-miRNA-mRNA層面的潛在生物標(biāo)志物為CALR、TP53、NR4A1、EGR1、IER2、IER3、IFRD1(mRNA層面)，miR-146b-5p、miR-199a-5p、miR-3196、miR-3656(miRNA層面)，CTB-114C7.4、CTA-384D8.35(lncRNA層面)，確立的CHD血瘀證生物標(biāo)志物可用于人群的證候篩查，實現(xiàn)證候的早期診斷、早期治療，也可利用CHD血瘀證生物標(biāo)志物進(jìn)行基因分型，分析藥物敏感性，提高療效。

因而，系統(tǒng)生物學(xué)認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄圖譜特征模式可用于CHD的早期確診及風(fēng)險性預(yù)測，也可作為CHD的治療靶點，聯(lián)合運(yùn)用中醫(yī)藥特色治療方案更加及時有效地防治CHD。今后中醫(yī)藥防治CHD疾病進(jìn)展的研究中可將轉(zhuǎn)錄圖譜特征模式差異表達(dá)作為衡量臨床療效的客觀化、科學(xué)化評價標(biāo)準(zhǔn)，從而可以促進(jìn)中醫(yī)藥CHD研究的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、客觀化和國際化[24]。

4 基因組學(xué)在CHD中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

目前大量研究證實，CHD是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的一種多基因復(fù)雜疾病[25]，其中遺傳因素作用占40%～60%[26]。目前，應(yīng)用全基因組外顯子測序?qū)HD相關(guān)基因進(jìn)行定位和識別日益成為當(dāng)下醫(yī)學(xué)研究的熱點?；蚪M學(xué)是研究基因的結(jié)構(gòu)功能、組成定位、產(chǎn)物編輯的學(xué)科，包括基因組高通量測序、表觀基因組學(xué)、核苷酸序列分析、宏基因組學(xué)等技術(shù)[27]。羅春艷[28]運(yùn)用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)分析冠心病易感變異位點rs6903956以及易感基因ADTRP，結(jié)果顯示，ADTRP干擾后可上調(diào)7個組蛋白基因，下調(diào)4個細(xì)胞周期調(diào)控基因，上調(diào)2個細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)。袁肇凱等[29]應(yīng)用高通量寡核苷酸基因芯片技術(shù)研究CHD血瘀證家系差異基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示家系CHD血瘀證相關(guān)的差異基因表達(dá)譜中共篩選得到8個差異基因表達(dá)異常，其中4個家系CHD血瘀證相關(guān)差異基因表達(dá)升高，4個家系CHD血瘀證相關(guān)差異基因表達(dá)降低，并通過基因本體論篩選出與遺傳相關(guān)的目標(biāo)通路，通路分析顯示差異主要涉及基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子、補(bǔ)體系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子、白細(xì)胞介素、成纖維細(xì)胞生長因子。陳光等[30]總結(jié)發(fā)現(xiàn)對于CHD血瘀證單核苷酸多態(tài)性研究主要涉及PAF-AH基因、血管緊張素原基因、血小板膜糖蛋白Ⅲa基因、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因，且PAF-AH基因R92H、I198T多態(tài)性與CHD血瘀證聯(lián)系密切。

中藥復(fù)方的配伍規(guī)律、組方機(jī)理、藥效機(jī)能對于基因功能的調(diào)節(jié)是中醫(yī)學(xué)利用系統(tǒng)生物學(xué)的應(yīng)用實例[32]。因而，系統(tǒng)生物學(xué)認(rèn)為，利用基因組學(xué)技術(shù)以預(yù)測疾病發(fā)生發(fā)展的診療思路和中醫(yī)“治未病”思想不謀而合，以中醫(yī)藥獨特優(yōu)勢延緩CHD疾病過程的快速進(jìn)展[31]，亦可依據(jù)基因組學(xué)的結(jié)果分析個體差異，根據(jù)患者的年齡、體質(zhì)、地理環(huán)境、季節(jié)特點、病因病機(jī)的不同對CHD患者采取個體化診療方案，這與目前精準(zhǔn)醫(yī)療研究思維相一致。

5 系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)在CHD中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)的研究思路本質(zhì)在于多信息融合和體系模型的構(gòu)建，多層次、全方位對生物體內(nèi)的生命活動進(jìn)行檢測，分析整合數(shù)據(jù)并進(jìn)行模擬歸納的學(xué)科[33]。系統(tǒng)生物學(xué)將從系統(tǒng)水平以整體性視角闡釋中醫(yī)藥多成分、多層次、多靶點、多途徑、多通路的潛在治療機(jī)制和治病作用機(jī)理。CHD是一種慢性復(fù)雜性進(jìn)展性疾病，基于系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)的中醫(yī)藥研究在CHD防治上具有獨特的優(yōu)勢和特點。系統(tǒng)生物學(xué)不僅使中醫(yī)藥優(yōu)勢和特點得以充分利用、充分發(fā)揮，同時運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)進(jìn)行生信數(shù)據(jù)挖掘與分析利用的全面篩選整合歸納，使其納入到標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化、客觀化的快速發(fā)展模式，亦將大大提高中醫(yī)藥對CHD的臨床效能[34]。

6 小結(jié)

系統(tǒng)生物學(xué)是當(dāng)下醫(yī)學(xué)和生物學(xué)發(fā)展的核心驅(qū)動力?；蛐酒?、蛋白質(zhì)芯片、生物質(zhì)譜分析、生信數(shù)據(jù)挖掘等高新技術(shù)與科學(xué)手段的聯(lián)合應(yīng)用將為推動中醫(yī)藥防治CHD的理論與實踐發(fā)展提供可視化研究平臺。因此，中醫(yī)藥防治CHD的基礎(chǔ)研究、臨床試驗與系統(tǒng)生物學(xué)組學(xué)技術(shù)的良性互動結(jié)合，必將成為今后中醫(yī)藥防治CHD現(xiàn)代化研究的熱點方向、重要任務(wù)。同時，系統(tǒng)生物學(xué)的研究還需不斷推出新的軟件開發(fā)工具、信息分析技術(shù)、系統(tǒng)測量方法和實驗設(shè)計方法，創(chuàng)造出獨具中醫(yī)藥特色與優(yōu)勢、以整體性、功能性、動態(tài)性揭示中醫(yī)藥CHD各證型的生物學(xué)本質(zhì)以及中藥復(fù)方作用機(jī)制的預(yù)防科學(xué)體系。