NLRP3參與的細胞焦亡在眼科疾病的研究進展

宋兆威，李志堅，王曉慧，李華章

0引言

炎性體是位于細胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白復(fù)合物，它負(fù)責(zé)促進炎性細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)的成熟，以及激活高度炎癥形式的細胞死亡和焦亡。在感染或細胞應(yīng)激后，炎性體被組裝、激活并參與疾病的宿主防御和疾病的病理生理過程[1]。

經(jīng)典炎性體是響應(yīng)病原相關(guān)分子模式(PAMP)或損傷相關(guān)分子模式(DAMP)而在細胞質(zhì)中激活caspase-1的媒介。 典型炎癥小體由輔助蛋白和自身寡聚化支架蛋白組成，通常屬于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)家族。 NLR蛋白含有三個共同結(jié)構(gòu)域：C末端富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)，中心核苷酸結(jié)合寡聚化(NOD / NACHT)結(jié)構(gòu)域和N末端半胱天冬酶募集(CARD)或pyrin(PYD)結(jié)構(gòu)域。 黑色素瘤-2(AIM2)蛋白中不存在的非NLR含有PYD信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和結(jié)合HIN-200結(jié)構(gòu)域的DNA。 LRR負(fù)責(zé)配體識別和自身抑制，NACHT結(jié)構(gòu)域使用ATP激活信號復(fù)合物，CARD / PYD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)同型蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。 迄今已鑒定出四種經(jīng)典炎性體——NLRP1，NLRP3，NLRC4和AIM2[2]。含 Pryrin 結(jié)構(gòu)域蛋白 3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性體是目前研究較多的炎性小體，大量活性氧(ROS)產(chǎn)生后能夠激活NLRP3，而NLRP3激活后可以活化caspase-1，引起細胞焦亡。細胞焦亡是近年來的研究熱點，NLRP3在焦亡通路中扮演著重要角色，目前在眼部疾病中對其的相關(guān)研究較少，對NLRP3的進一步研究對眼科疾病的診療有著重要意義。

1含Pryrin結(jié)構(gòu)域蛋白炎性體

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD) 樣受體家族NLRP3炎性體是針對廣泛的微生物病原體和醫(yī)學(xué)相關(guān)物質(zhì)(例如結(jié)晶)而組裝的。組裝后，炎性體可作為pro-caspase-1的活化平臺。然后，活化的caspase-1將IL-1β/ 18的前體加工成成熟形式[3]。NLRP3炎性體的形成和活化可能是許多退行性疾病的關(guān)鍵致病機制，如動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、腎小球硬化、肺纖維化和肝硬化[4-7]等。

NLRP3炎性體的激活需要兩個信號：信號1是來自TLR或細胞因子受體的引發(fā)信號;信號2是來自危險信號或微生物產(chǎn)物的激活信號，通常導(dǎo)致細胞鉀外流和線粒體ROS產(chǎn)生[8]。引起NLRP3炎性體激活的形式包括：ATP和K+外排、溶酶體不穩(wěn)定和無效的吞噬作用、ROS、ER應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、Ca2+信號傳導(dǎo)、去泛素化、微小RNA(miRNA)，其中最重要的是ROS[1]。

2細胞焦亡

焦亡(pyroptosis)是細胞死亡的促炎形式，并且依賴于IL-1β、IL-18和警報HMGB-1。Caspase-1是炎癥性半胱天冬酶的前體，以pro-caspase-1(一種無活性的酶原)的形式存在于細胞胞質(zhì)中。pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的促炎細胞因子IL-1β和IL-18需要caspase-1的激活?；罨腸aspase-1可引起細胞焦亡，其特征是細胞裂解和細胞質(zhì)內(nèi)容物釋放到細胞外空間。

形態(tài)學(xué)上，細胞焦亡似乎是細胞凋亡和細胞壞死的組合，涉及質(zhì)膜完整性的破壞和細胞質(zhì)內(nèi)容物向細胞外空間釋放。焦亡細胞的質(zhì)膜出現(xiàn)破裂，隨后迅速重新密封和腫脹，并在細胞核周圍形成一個球狀的囊泡。在細胞焦亡期間，垂死細胞的大小會出現(xiàn)顯著的增加。隨著焦亡細胞的膨脹，細胞核變圓、皺縮。與凋亡細胞相反，焦亡細胞保持了核的完整性； 與凋亡細胞相同，焦亡細胞的DNA片段化，在TUNEL染色下表達陽性[2]。

3 NLRP3炎癥小體與細胞焦亡的關(guān)系

除了IL-1β和IL-18的成熟之外，焦亡還與炎性體的激活有關(guān)[9]。焦亡的特點包括caspase-1依賴，DNA片段化，細胞膜完整性的快速喪失和炎性細胞因子釋放[10]。炎性體的生化功能是激活caspase-1使IL-1β和IL-18成熟以及誘導(dǎo)細胞焦亡。細胞被外界刺激誘導(dǎo)caspase-1活化的過程離不開炎癥小體的調(diào)節(jié)與控制，所以炎癥小體的激活與活化是細胞焦亡的關(guān)鍵步驟。

4眼部相關(guān)疾病的研究

4.1 NLRP3與年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種神經(jīng)退行性疾病，可侵襲黃斑，造成不可逆轉(zhuǎn)的失明。對于干性ARMD，目前沒有有效的方法可以緩解和治療，視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)死亡和繼發(fā)性光感受器變性這兩種特征性變化導(dǎo)致干性ARMD晚期的中心視力喪失。因此，了解對視網(wǎng)膜造成破壞性影響的基本機制及因素至關(guān)重要[11]。

ARMD中RPE細胞死亡的機制尚未完全闡明。幾項臨床和實驗證據(jù)表明，氧化和脂褐素介導(dǎo)的光氧化損傷具有重要的病理生理作用[12]。NLRP3炎性體也有助于繼發(fā)于ARMD的RPE細胞死亡[13-14]。實際上，已經(jīng)在受ARMD影響的RPE細胞中證實了NLRP3炎性體的激活[13,15],并且有報道發(fā)現(xiàn)ARMD患者的玻璃體內(nèi)和全身的IL-1β和IL-18的水平增加[16-17]。Carolina 等[10]發(fā)現(xiàn)未接觸炎性小體的細胞表現(xiàn)出延遲的細胞裂解、質(zhì)膜起泡和細胞收縮，TUNEL陽性DNA片段化，膜聯(lián)蛋白V陽性/ PI陰性細胞染色，以及缺乏IL-1β和IL-18釋放。 相反，接觸炎性小體的細胞表現(xiàn)出細胞腫脹和早期細胞裂解，TUNEL陽性DNA降解，PI陽性細胞染色，caspase-1活化和IL-1β和IL-18的釋放[18]。研究結(jié)果表明，接觸炎性小體可以將RPE細胞中光氧化損傷誘導(dǎo)細胞的死亡機制從細胞凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎雇?。Wang等[19]觀察到ARMD患者中NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的mRNA水平增加。在體外，成體視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)細胞系中的氧化應(yīng)激或脂多糖(LPS)刺激引起類似的增加，并且siRNA轉(zhuǎn)染的敲除NLRP3的細胞中這種增加受到抑制。 表明外源性炎癥刺激和氧化應(yīng)激都可以通過caspase-1激活觸發(fā)人RPE細胞中的NLRP3炎性體激活。以上數(shù)據(jù)表明，NLRP3及細胞焦亡在ARMD的發(fā)生機制中起到了關(guān)鍵的作用，讓我們對未來ARMD的治療有了新的想法和思路，NLRP3可以作為以后ARMD研究與治療的新的靶點。

4.2 NLRP3與年齡相關(guān)性白內(nèi)障年齡相關(guān)性白內(nèi)障多見于50歲以上的中老年人，是目前全球主要的致盲原因，但其發(fā)病機制至今尚未闡明，了解白內(nèi)障的發(fā)病機制及其通路中的相關(guān)因子，可以為今后預(yù)防及治療白內(nèi)障提供新的有效方式。

Alexander[20]的研究顯示VEGF-A的增加足以引起眼部的多種老化疾病，包括白內(nèi)障以及ARMD。在晶狀體中，VEGF-A的增加誘導(dǎo)了與ERK過度活化相關(guān)的年齡相關(guān)性混濁，氧化損傷和IL-1β的更高表達。靶向NLRP3炎性體組分或Il1r1不僅強烈抑制VEGF-A誘導(dǎo)的白內(nèi)障形成，而且強烈抑制ARMD的形成。這些發(fā)現(xiàn)表明VEGF-A誘導(dǎo)的和NLRP3炎性體介導(dǎo)的IL-1β激活對多種不同的眼部老化疾病具有共同的致病作用，靶向NLRP3或Il1r1可以抑制VEGF-A誘導(dǎo)的年齡相關(guān)的白內(nèi)障發(fā)生。據(jù)報道NLRP3炎性體的特定化學(xué)抑制劑可用于治療這些老化疾病[21]。IL-1β阻斷劑在預(yù)防或抑制ARMD或與年齡相關(guān)性白內(nèi)障形成方面也具有臨床益處[22]。在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成機制中，NLRP3占有重要的中心地位，NLRP3抑制劑可以有效抑制這個過程的發(fā)生，所以NLRP3抑制劑可以作為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的一種新型治療與緩解方式給我們新的啟發(fā)與探索的方向。

4.3 NLRP3與翼狀胬肉翼狀胬肉是一種眼表疾病，特征在于鼻側(cè)結(jié)膜上的翼狀增殖組織，能阻礙視力，引起炎癥并影響外觀[23]?，F(xiàn)在手術(shù)仍然是翼狀胬肉的主要治療方法，但會引起復(fù)發(fā)，移植物壞死和形成肉芽腫等并發(fā)癥[24]。盡管已經(jīng)用了很多方法來避免復(fù)發(fā)，但效果并不明顯[25]。 因此，了解翼狀胬肉的形成機制對于治療和降低其發(fā)病率至關(guān)重要。

Sun等[23]通過原代培養(yǎng)人結(jié)膜上皮細胞(HConECs)和人翼狀胬肉成纖維細胞(HPF)，檢測出與結(jié)膜細胞相關(guān)的因子水平。抑制caspase-1以限制caspase-1依賴性的細胞凋亡后，測量下游因子IL-18和IL-1β。發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉中的炎性因子表達顯著增加，并且在H2O2處理的HPF和HConECs中存在caspase-1依賴性的上皮細胞焦亡，炎性因子的表達顯著升高并且下游因子IL-18和IL-1β也升高。在caspase-1抑制后，IL-18和IL-1β的增加受到抑制。焦亡在翼狀胬肉形成和進展的病理過程中發(fā)揮作用。

翼狀胬肉的常見原因如紫外線輻射和其他類型的氧化應(yīng)激，可以作為DAMPs引發(fā)細胞焦亡。在發(fā)生焦亡后，IL-18和IL-1β被激活并大量釋放。激活的IL-18和IL-1β引起各種變化，例如纖維化、EMT、細胞凋亡和異常細胞增殖，所有這些都包括在翼狀胬肉發(fā)生的機制中。因此，HPFs中這些焦亡因子的升高，是翼狀胬肉的主要組成部分，可能在翼狀胬肉的進展中起相當(dāng)大的作用。NLRP3參與的細胞焦亡在翼狀胬肉形成和進展中的重要作用使我們更好地了解翼狀胬肉，并發(fā)現(xiàn)了翼狀胬肉治療的新的可能性，這將為今后翼狀胬肉的治療提供新的方法和思路。

4.4 NLRP3與糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種多因素疾病，具有微血管、神經(jīng)變性，遺傳/表觀遺傳，免疫和炎癥相關(guān)因子的復(fù)雜相互作用。 根據(jù)微血管變性和缺血性損傷的程度，DR可分為非增殖期(NPDR)和增殖期(PDR)[26]。

Sirpa等[27]研究結(jié)果支持NLRP3炎性體在PDR中是激活狀態(tài)。 抗VEGF治療降低了NPDR患者玻璃體中caspase-1的水平，提示炎癥小體激活也參與NPDR，并且也支持炎性體和VEGF之間存在聯(lián)系。 在患有牽拉性視網(wǎng)膜脫離(TRD)和新生血管形成等嚴(yán)重形式的PDR患者眼中觀察到高水平的NLRP3。 與NPDR玻璃體樣本相比，在PDR眼中檢測到更高水平的IL-18。Mcc950是NLRP3炎性體的有效特異性抑制劑，Zhang 等[28]評估了Mcc950對高葡萄糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(HRECs)的抗炎作用以及潛在的相關(guān)機制。在來自DR患者的手術(shù)切除的增殖膜中，觀察到NLRP3、caspase-1和IL-1β的高表達。在高葡萄糖刺激的HRECs中，Mcc950抑制了NLRP3炎性體的激活和細胞凋亡。Chen 等[29]發(fā)現(xiàn)從DR患者獲得的外周血單核細胞(PBMC)中NLRP3炎性體的表達升高; 在PBMC和玻璃體液中也觀察到包括IL-1β和IL-18的促炎細胞因子水平升高。 這些數(shù)據(jù)表明NLRP3炎性體的激活可能促進DR的進展。這些發(fā)現(xiàn)使我們對DR的發(fā)病機制和發(fā)生發(fā)展有了進一步了解，其中NLRP3作為DR治療的潛在因子，需要我們進一步闡明及探索NLRP3炎性體在DR形成過程中的分子機制。

4.5 NLRP3與干眼癥干眼癥(dry eye，DE)是最常見的眼表疾病之一，嚴(yán)重影響人的生活質(zhì)量。 盡管尚未明確干眼癥的發(fā)病機制，但越來越多的證據(jù)表明，眼表面的免疫炎癥可能在干眼癥的病理損害中起著重要作用[30-31]。但干眼癥炎癥發(fā)生發(fā)展的確切機制現(xiàn)在仍不清楚。

活性氧物質(zhì)可激活NLRP3炎癥小體并導(dǎo)致干眼小鼠模型中caspase-1自身激活和促炎細胞因子IL-1β的成熟[32]。Niu 等[33]的研究顯示干燥綜合征干眼癥(SSDE)受試者中NLRP3 mRNA和蛋白質(zhì)表達與對照組相比顯著增加。非干燥綜合征干眼癥(NSSDE)的受試者也顯示出高水平的NLRP3 mRNA表達。這些發(fā)現(xiàn)表明NLRP3炎性體可能與干眼癥眼表炎癥的發(fā)展有關(guān)。SSDE組的基線淚膜破裂時間(tear break-up time，TBUT)，熒光素染色(fluorescein，F(xiàn)L)和Schirmer測試值均顯著低于NSSDE組中的數(shù)據(jù)。SSDE和NSSDE中NLRP3的表達水平可能與干眼癥的嚴(yán)重程度有關(guān)。Zheng 等[32]用智能控制環(huán)境系統(tǒng)(intelligent controlled environmental system，ICES)誘導(dǎo)雌性4～6周齡C57BL/6小鼠的蒸發(fā)過強型DE。在ICES暴露1wk后發(fā)生ROS的升高，其在三種NLRP3炎性體組分(即NLRP3、ASC和caspase-1)的基因表達增加之前導(dǎo)致IL-1β釋放的增加。 ICES暴露2wk后發(fā)生caspase-1活性增加。將含有0.3% N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)的滴眼液用于在ICES中飼養(yǎng)2wk的小鼠。NAC減少角膜熒光素染色并減少ROS產(chǎn)生，還下調(diào)NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA以及它們免疫染色的水平。它明顯減弱炎性體介導(dǎo)的caspase-1的催化活性。干眼癥小鼠模型顯示，ROS生成的增加引發(fā)NLRP3炎性體的復(fù)合和活化，導(dǎo)致生物活性IL-1β分泌增加。NLRP3表達的增加也與環(huán)境誘導(dǎo)的DE疾病的嚴(yán)重性相關(guān)。以上這些研究結(jié)果為發(fā)現(xiàn)干眼病的患者的治療提供了新的策略，開發(fā)抑制NLRP3復(fù)合物形成和活化的藥物可能為治療環(huán)境誘導(dǎo)的DE疾病提供新的治療選擇。

5小結(jié)

NLRP3炎癥小體在許多眼部疾病中起著至關(guān)重要的作用，是危險信號誘導(dǎo)疾病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。而炎性體的激活與活化是細胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟，NLRP3 炎性小體是炎癥反應(yīng)的核心，故而 NLRP3 炎性體與細胞焦亡的發(fā)生具有密切關(guān)系。目前，對其通路的確切機制以及分子間相互作用的研究較少。因此，進一步研究 NLRP3 介導(dǎo)的細胞焦亡通路在眼科疾病中的作用及機制，應(yīng)用相關(guān)生物制劑或生物學(xué)方法阻斷 NLRP3 的信號通路等研究，能夠?qū)ρ劭萍膊〉纳钊肓私饧爸委熖峁┬碌乃悸芳靶碌闹委煱悬c。