基因治療濕性年齡相關性黃斑變性的研究進展

張 依，王文俊，楊安懷

0 引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)又稱為老年性黃斑變性(senile macular degeneration,SMD)，患者多為50歲以上，雙眼先后發(fā)病或同時發(fā)病，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，是歐美等發(fā)達國家患者致盲最主要的原因。由于人口的老齡化，我國ARMD患者也日益增多[1-2]。目前，根據(jù)臨床表現(xiàn)及病理特征改變的不同可分為兩型：干性老年性黃斑變性(dry senile macular degeneration，dry-SMD)，或稱為非滲出型老年性黃斑變性(nonexudative senile macular degeneration)，或非新生血管性年齡相關性黃斑變性(non-neovascular age-related macular degeneration,non-NAMD)；濕性老年性黃斑變性(wet senile macular degeneration,wet-SMD)，或稱為滲出型老年性黃斑變性(exudative senile macular degeneration)，或新生血管性年齡相關性黃斑變性(neovascular age-related macular degeneration,NAMD)[1,3]。

1 NAMD的發(fā)病機制及致病因子

ARMD是一種多因素的變性疾病，其病因及發(fā)病機制尚不明確。可能與遺傳易感性、環(huán)境暴露、營養(yǎng)失調(diào)、代謝障礙、視網(wǎng)膜的慢性光損傷等因素有關。隨著年齡增長，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)功能障礙，RPE細胞內(nèi)物質(zhì)積聚，細胞外基質(zhì)異常地聚集于基底膜，在RPE層與Brush膜之間聚集形成玻璃膜疣(drusen)，這種聚齊物沿著Brush膜擴散增厚，最終光感受器和RPE細胞逐漸死亡，這一階段的疾病稱為non-NAMD或dry-SMD[1，3]。隨著病變的發(fā)展，大多數(shù)ARMD患者的中心視力進行性惡化，這是由于感光細胞和RPE層細胞死亡增多，導致視網(wǎng)膜局部萎縮，稱為地圖樣萎縮。遺傳研究表明，補體介導的炎癥損傷在ARMD的易感性中起著重要的作用[4-6]，但它究竟是如何發(fā)揮作用還不得而知?？偟膩碚f，目前對于non-NAMD的發(fā)病機制還沒有足夠了解，因此無法確定其治療的發(fā)展路徑。

大約20%的non-NAMD患者由于脈絡膜和(或)視網(wǎng)膜深層毛細血管的異常生長，侵犯視網(wǎng)膜下空間，最終轉(zhuǎn)變?yōu)镹AMD[3]。NAMD是以黃斑下脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成，血管發(fā)生滲漏、出血、水腫，最終形成纖維瘢痕為特點，致使中心視力進行性受損的嚴重致盲性疾病[1,7]。目前認為NAMD主要發(fā)病機制有以下兩點：(1)由于RPE細胞的應激或損傷以及相關的免疫反應促進血管內(nèi)皮生成因子(choroidal neovascularization，VEGF)的產(chǎn)生，從而驅(qū)動CNV的形成[8]。(2)脈絡膜血管系統(tǒng)的退行性改變是促進病理性血管生成的另一個可能的因素。從早期的ARMD患者的檢查可以發(fā)現(xiàn)，脈絡膜毛細血管和Sattler層的血管減少和(或)血流灌注的減低，可促使病理性血管的形成。無癥狀的病理性血管的改變可引起脈絡膜缺氧及VEGF分泌增多，導致病變血管的形成[7，9-10]。VEGF在新生血管形成、血管滲透增加中發(fā)揮重要的作用。在VEGF家族中，有VEGF A～F六個成員，其中VEGF-A是動物模型和人類NAMD的關鍵因子[11-12]。臨床觀察表明，玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF-A藥物，抑制了CNV的生成，減少血管的滲漏，顯著地改善了NAMD患者的預后。因此抗VEGF是治療NAMD的中心環(huán)節(jié)[12-13]。

2 基因治療的發(fā)展背景

目前，臨床上常用抗VEGF藥物治療NAMD，但是隨著大量的臨床應用，發(fā)現(xiàn)這種治療方法，需要頻繁持久的眼內(nèi)注射，增加了治療成本，且容易并發(fā)眼內(nèi)炎、眼壓升高及其他不良事件的風險，同時需要良好的依從性的配合，患者才得以保存中心視力[14]。隨著我國的人口老齡化，我們迫切需要給NAMD患者提供長期的治療方案，探索發(fā)展一種具有持續(xù)抗VEGF活性的治療方法，而基因治療為這種治療策略提供了一個可行的方案。

3 眼部基因治療的特點

基因治療的前提，需要將遺傳物質(zhì)傳遞到宿主細胞，以糾正功能失調(diào)的基因或編碼成治療蛋白[15]?；蛑委熗ǔａ槍我蛩刈冃约膊。壳按罅颗R床試驗數(shù)據(jù)表明，基因治療在眼科多因素變性疾病中發(fā)揮作用，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)和ARMD[3,16-17]。

眼睛作為基因治療的靶器官，其優(yōu)勢有以下幾點：(1)可以進行局部治療而不是靜脈注射，可以最大限度地減少基因載體的全身吸收，一旦被感染，眼部免疫相關機制會限制引發(fā)不必要的全身反應[18]。(2)由于眼睛體積小，極少量的載體濃度足以達到基因治療的水平。(3)眼部的局部解剖，顯示出高度的生理分隔，使特定的細胞群體容易成為治療目標。(4)光學介質(zhì)的透明性使得眼科相關檢查如視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)、光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)、熒光素鈉眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)等易于進行評估[16]。

4 常見的基因治療NAMD的方法

基因治療NAMD可以提供長期持續(xù)表達抗VEGF作用的蛋白質(zhì)。這種治療方式中，遺傳信息的傳遞需要病毒作為載體。目前用于眼基因治療的臨床試驗中常用的病毒載體包括腺病毒(adenovirus)、腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)載體，即細小病毒家族的小單鏈DNA病毒，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中的慢病毒(lentiviral,LV)即RNA病毒。這兩類病毒都可以轉(zhuǎn)染非分裂細胞，但腺病毒及AAV載體轉(zhuǎn)染細胞是不整合的，而LV載體可將外源基因整合到宿主細胞基因組中，具有更大的轉(zhuǎn)基因能力[13-14]。在成功轉(zhuǎn)染后，靶細胞轉(zhuǎn)錄并將病毒攜帶的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化為治療蛋白，發(fā)揮治療的作用。

4.1色素上皮衍生因子色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)是一種較強的抗血管生成因子，在內(nèi)皮細胞增殖過程中具有促進細胞凋亡的作用[19]。在2006年,Campochiaro等[20]發(fā)布了使用表達人PEDF的腺病毒載體(AdPEDF.11)進行Ⅰ期臨床試驗(NCT00109499)的結(jié)果。在他們的多中心、劑量遞增的研究中，給予28例晚期NAMD的患者玻璃體腔內(nèi)注射AdPEDF.11，觀察發(fā)現(xiàn)注射后的幾個月，沒有嚴重的不良事件及毒副作用，而且其抗血管生成作用可以持續(xù)幾個月,高劑量載體治療組患者1a后的病變大小穩(wěn)定?？寡苌苫钚约拜d體良好的安全性足夠支持Ⅱ期臨床試驗來測試載體的有效性。然而，可能由于以下原因，目前并沒有針對腺病毒的進一步臨床試驗：(1)Campochiaro等的研究小組早期進行的研究是在幾種小鼠模型中使用編碼人PEDF的腺病毒靶向抑制新生血管的形成[21-22]，在基因治療的發(fā)展史中，被證明與猝死有關[23]；(2)腺病毒缺乏靶向性，且具有較強的免疫原性，尤其是基因治療持續(xù)時間短等特點[24]，與基因治療NAMD需要長期穩(wěn)定地表達抗VEGF蛋白的設計思路背道而馳。隨后Campochiaro等通過試驗使用表達人PEDF的AAV載體，研究抑制新生血管形成的作用[25]。AAV載體可持續(xù)表達人PEDF，在小鼠模型中尚未發(fā)現(xiàn)病毒毒性，長期表達PEDF對眼睛的影響需要進一步的研究，但利用AAV載體表達人PEDF在未來可能是一個可行的臨床試驗。

4.2可溶性的血管內(nèi)皮生長因子受體-1由Genzyme贊助的Ⅰ期臨床試驗(NCT01024998)，是在美國四家視網(wǎng)膜門診所進行的一個劑量遞增的開放標簽試驗，可溶性的血管內(nèi)皮生長因子受體-1(soluble VEGF receptor 1,sFlt-1)成為研究的靶點。在19例晚期NAMD患眼的玻璃體腔內(nèi)注射編碼sFlt-1的AAV2載體(a recombinant AAV2 encoding sFlt-1，AAV2.sFLT1),隨訪52wk，通過測定房水中sFlt-1和AAV2中和抗體(neutralizingantibody，NAbs)的水平，證實了玻璃腔內(nèi)注射所有劑量下都具有良好的耐受性。然而，在接受最大劑量的患者中，有50%患者沒有檢測到sFlt-1。在sFlt-1表達陽性的患者中，4/5患者沒有測到NAbs，而另1例患者的滴度非常低(1∶100)。在5例給予最大劑量而無sFlt-1表達的患者中，4/5患者的NAbs滴度較高，1例無NAbs。這項研究結(jié)果表明，需要對高劑量的AAV2.sFlt-1的安全性和有效性進一步驗證，同時，是否NAbs的存在對靶基因的表達有影響，尚須進一步的研究[26-27]。

在澳大利亞進行了第2個Ⅰ期、Ⅱa期的單中心、隨機對照臨床試驗(NCT01494805)，Ⅰ期、Ⅱa期分別招募9例患者和32例患者，符合入選標準條件下所有的患者在治療之初及第4wk接受玻璃體腔內(nèi)注射雷珠單抗的治療，然后每4wk隨訪患者的不良事件及最佳矯正視力(best corrected visual acuity,BCVA)的變化,必要時可給予雷珠單抗的補救治療。Ⅰ期臨床試驗雖然不足以評價載體的療效，但可初步說明視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFLT-1(AVA-101)的可重復性，值得注意的是，4/6接受治療的患者不需要補救治療，2/6患者在隨訪近4mo的治療期間需要1次補救治療[28]。因此該臨床試驗結(jié)果表明，視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFlt-1是安全的、耐受性良好，而Ⅱa期的臨床試驗進一步驗證了Ⅰ期臨床試驗的結(jié)果，但并沒有新結(jié)果的發(fā)現(xiàn)[29]。隨后，Rakoczy等[30]在前期的臨床研究的基礎上公布了Ⅰ期/Ⅱa期視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFLT-1治療滲出性年齡相關性黃斑變性的臨床研究結(jié)果，結(jié)果同之前無異，同樣由于樣本量少，無法證實生物學效應，但它同樣證實了視網(wǎng)膜下注射rAAV.sFlt-1是安全的，同時在老年人中耐受性良好。

4.3 AA8載體介導的抗人VEGF抗體片段Liu等[31]在表達人VEGF的轉(zhuǎn)基因小鼠中建立Ⅲ型CNV，通過視網(wǎng)膜下注射不同劑量的AA8載體介導的抗人VEGF抗體片段(AAV8-antiVEGFfab)，可以觀察到AAV8-antiVEGFfab的抗血管生成及抗血管滲透的作用。研究結(jié)果表明，小鼠眼部注射≥1×107基因拷貝數(shù)(gene copy,GC)的AAV8-antiVEGFfab比無載體注射可顯著地減少視網(wǎng)膜新生血管(neovascular,NV)的區(qū)域，劑量依賴反應可以被觀察到，≤3×107的GC可輕度地減少視網(wǎng)膜新生血管，≥1×108的GC可減少50% NV,3×109或1×1010的GC可幾乎完全消除NV。這項研究強烈地支持在NAMD患者中開展視網(wǎng)膜下注射AAV8-antiVEGFfab的臨床試驗。

AAV8-antiVEGFfab目前也被Regenxbio公司贊助的Ⅰ期臨床試驗(NCT03066258)作為研究目標，他們正在評估AAV8-antiVEGFfab(RGX-314)的安全性和耐受性，RGX-314是一種編碼可溶性抗VEGF蛋白的AAV8載體的藥物。RGX-314旨在對抗因眼睛中形成的NV而引起視力的喪失，從而減少對抗VEGF藥物注射頻率的需求。該研究中納入18例晚期NAMD患者，分別接受3種不同劑量的基因治療。從Regenxbio公司公布的Ⅰ期臨床試驗的中期數(shù)據(jù)可以看出，基因療法RGX-314在所有劑量下都是安全且耐受良好的，所有三組的蛋白質(zhì)表達水平均呈劑量依賴性增高，抗VEGF藥物的注射頻率也呈劑量依賴性減少[27，32]。

4.4內(nèi)皮抑素和血管抑素內(nèi)皮抑素(endostatin)是膠原蛋白18的裂解產(chǎn)物，內(nèi)源性內(nèi)皮抑素在抑制實驗小鼠CNV模型中得到了驗證[33]。血管抑素(angiostatin)是纖容酶原的一個片段，在激光誘導的CNV大鼠模型中，視網(wǎng)膜下注射AAV-Angiostatin可以顯著減小CNV的病變范圍[34]。由Campochiaro等發(fā)布了針對晚期NAMD患者的Ⅰ期劑量遞增的臨床試驗——Endostatin/Angiostatin基因轉(zhuǎn)錄治療黃斑變性的研究結(jié)果(GME研究，NCT01301443)，檢測表達Endostatin/Angiostatin的馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)載體的安全性和生物活性。結(jié)果顯示，在該研究的受試對象中，房水中檢測到Endostatin/Angiostatin的水平與載體劑量相關，持續(xù)高水平的Endostatin/Angiostatin在眼內(nèi)表達可減少FFA中CNV的滲漏，但并不能可靠地消除晚期NAMD患者視網(wǎng)膜下和(或)視網(wǎng)膜內(nèi)液體。每個劑量組的受試患者的耐受性良好，沒有劑量限制的毒性，幾乎沒有眼部炎癥的發(fā)生。與手術相關的嚴重不良事件為黃斑裂孔，在治療過程中結(jié)局良好。因此視網(wǎng)膜下注射EIAV-Endostatin/Angiostatin(RetinoStat?)是安全的，耐受性良好，可持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達，重復性好[35]。

4.5抗VEGF rAAV-cDNA抗VEGF rAAV-cDNA(ADVM-022/ADVM-O32)是一種編碼阿柏西普(aflibercept)/雷珠單抗(ranibizumab)的優(yōu)化的腺相關病毒載體的藥物，主要被用于玻璃體腔內(nèi)注射，以傳遞目的基因和高水平表達治療蛋白。這些療法尚處于臨床前期的研究階段。目前，ADVM-022的臨床前期工作結(jié)束，結(jié)果顯示，在激光誘導的非人類靈長類動物的CNV模型中，玻璃體腔內(nèi)注射ADVM-022的動物模型耐受性良好，可致持續(xù)生成aflibercept，類似于長期持續(xù)aflibercept作用的效果。此外，在激光照射前13mo給予ADVM-022可預防臨床相關的CNV病變的發(fā)生，類似于動物CNV模型接受aflibercept的護理標準。結(jié)果表明，單次玻璃體腔內(nèi)注射ADVM-022可能為wet-ARMD提供一種安全有效的長期治療方案，并可能最終改善患者的視力結(jié)果[36]。ADVM-032仍處于臨床前期的研究階段，尚未公布相關研究的臨床前試驗的數(shù)據(jù)及結(jié)果。

4.6抗TANK結(jié)合激酶1單克隆抗體抗TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)，又稱NF-κB激活激酶(NF-κB-activating kinase,NAK)，是一種廣泛表達色氨酸、絲氨酸的激酶，它屬于非典型性的IκB激酶，在調(diào)節(jié)I型干擾素(interferon，IFN)的產(chǎn)生和IFN調(diào)節(jié)因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)與NF-κB的信號通路中起重要的作用[37]。在之前的研究中證實，TBK1參與多種細胞途徑的激活和促炎因子的產(chǎn)生，以及細胞生長和增殖等細胞穩(wěn)態(tài)等功能[38-40]。并且，TBK1可誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖，是腫瘤血管形成的新介質(zhì)，同時它也可以上調(diào)炎性因子的生成發(fā)揮促炎作用，盡管一些研究暗示了TBK1在血管生成和炎癥中的作用，但TBK1在CNV中的作用還未得到驗證[41-43]。而在Cui等[37]開展的試驗研究中證實，TBK1可以促進脈絡膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞系(A choroid-retinal endothelial cell line,RF/6A)的增殖和成管，增加VEGF的表達，在激光誘導形成CNV的鼠模型中，玻璃體腔內(nèi)注射抗TBK1單克隆抗體可顯著地減少CNV的形成，這個研究結(jié)果表明TBK1是治療NAMD的潛在靶點。

5 結(jié)局和展望

基因治療在眼病的治療和失明的預防方面顯示出巨大的前景。前期的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，基因治療對視網(wǎng)膜和(或)脈絡膜CNV的形成、VEGF水平的高表達有抑制作用，但目前尚不清楚，長期持續(xù)有效的VEGF阻斷是否會對正常脈絡膜血管和視網(wǎng)膜光感細胞產(chǎn)生不良影響。此外，同抗VEGF中和蛋白的治療相似，抗VEGF基因治療效果的喪失是對NAMD的另一個重要的臨床問題。盡管基因療法在治療濕性年齡相關性黃斑變性中展現(xiàn)出積極的效果，但仍需要大量臨床前期的研究結(jié)果來驗證這些問題，同時可為后期臨床試驗奠定基礎。