神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)機(jī)制中的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

岳倩文 綜述 夏鉑 審校

(寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

脊髓損傷嚴(yán)重?fù)p害患者的脊髓結(jié)構(gòu)及功能，引起其運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)以及自主神經(jīng)功能障礙或喪失，臨床上治療難度較大，且預(yù)后不良[1]。脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)的作用機(jī)制目前尚不明確，當(dāng)前研究熱點(diǎn)主要集中在脊髓損傷后神經(jīng)干細(xì)胞的移植及其替代治療上，鑒于此作者從神經(jīng)干細(xì)胞入手，探討脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀。

1 神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞主要位于側(cè)腦室下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下區(qū) (SGZ)[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化潛能，并總結(jié)出神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)處于未分化狀態(tài)能夠自我更新復(fù)制，分化為神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新，通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂產(chǎn)生除自身以外的其他細(xì)胞，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的干細(xì)胞。通常所說(shuō)的神經(jīng)干細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的干細(xì)胞，按照部位分類(lèi)分為中樞神經(jīng)干細(xì)胞(CNS-SC)和外周神經(jīng)干細(xì)胞(PNSC)又稱(chēng)神經(jīng)嵴干細(xì)胞(NCSC)。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞可分為：胚胎干細(xì)胞(ESC)、成體神經(jīng)干細(xì)胞(ASC)、胚體神經(jīng)干細(xì)胞(FSC)。

ASC可從自身獲得是最適合的供體，但因分化能力有使得ASC的應(yīng)用范圍受到限制。人的脊髓內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞，在脊髓損傷后患者會(huì)出現(xiàn)遺留截癱，排便障礙、感覺(jué)障礙等后遺癥。神經(jīng)干細(xì)胞在研究神經(jīng)發(fā)育及中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植和替代治療起著重要作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞具有再生成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，但神經(jīng)干細(xì)胞的分裂、增生活動(dòng)需要能量支持，按照調(diào)節(jié)因素可分為內(nèi)源性和外源性[4]。

1.1內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞可以避免不良的免疫反應(yīng)，避免了移植細(xì)胞階段存在的倫理道德問(wèn)題。當(dāng)實(shí)驗(yàn)采用輕度脊髓損傷的大鼠模型探索脊髓損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后大鼠脊髓背側(cè)出現(xiàn)出血灶，病灶周?chē)菭罴?xì)胞的樹(shù)突變厚和變寬并逐步形成膠質(zhì)瘢痕。經(jīng)DAPI染色后位于中央管的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)增殖，脊髓中央管內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在輕度脊髓損傷后分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，提示大鼠中的輕度脊髓損傷足以誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化[5]。研究[6]表明，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞廣泛增殖以應(yīng)對(duì)脊髓損傷情況。脊髓損傷發(fā)生后首先破壞血管系統(tǒng)，造成缺氧，但缺氧有利于膠質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)張，隨后細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌，激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，促進(jìn)增殖[7]。

1.2外源性神經(jīng)干細(xì)胞 Y.Zhao[8]發(fā)現(xiàn)支架的植入增加了神經(jīng)元分化，減少了星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，阻止了髓鞘對(duì)神經(jīng)元分化的抑制，從而促進(jìn)神經(jīng)元傳遞及運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。但外源性神經(jīng)干細(xì)胞的脆弱性，無(wú)法增殖分化為神經(jīng)元的局限性，決定了其不能成為神經(jīng)干細(xì)胞移植的理想細(xì)胞來(lái)源。在嚴(yán)重的脊髓損傷中，僅有小部分外源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元而大多數(shù)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞[9]。

2 神經(jīng)干細(xì)胞與脊髓損傷修復(fù)

對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，細(xì)胞因子及其所在微環(huán)境是影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的因素，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏會(huì)導(dǎo)致脊髓再生障礙，而神經(jīng)干細(xì)胞能否再生為新的神經(jīng)元或軸突能否再生很大程度上取決于其中樞神經(jīng)系統(tǒng)所在的微環(huán)境。通過(guò)中和表皮生長(zhǎng)因子受體來(lái)改變這種不利的微環(huán)境信號(hào)傳導(dǎo)可能在損傷部位誘導(dǎo)出更多的神經(jīng)元，加速脊髓功能恢復(fù)。X.Li[6]將植入西妥昔單抗修飾的線(xiàn)性有序膠原支架(locs)進(jìn)入犬脊髓損傷部位，西妥昔單抗作為一種表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)的拮抗劑，在增殖的神經(jīng)干細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)被大量激活并產(chǎn)生新的神經(jīng)元。

2.1神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境 神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境主要包括:神經(jīng)干細(xì)胞相鄰的支持細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和微血管網(wǎng)。脊髓損傷后微環(huán)境遭到破壞會(huì)相繼出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、微循環(huán)障礙、軸突斷裂、細(xì)胞凋亡等過(guò)程[10]。脊髓神經(jīng)干細(xì)胞從靜止到增殖的轉(zhuǎn)變與脊髓損傷后微環(huán)境的變化有關(guān)。脊髓損傷所形成的炎性微環(huán)境會(huì)使其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化而限制其向神經(jīng)元分化。脊髓損傷后產(chǎn)生IL-1、IL-6等神經(jīng)毒性物質(zhì)[11]，使得神經(jīng)干細(xì)胞死亡或分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，形成抑制軸突再生的不利微環(huán)境，可能是影響脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵因素。在嚴(yán)重的脊髓損傷發(fā)生后，其缺乏所必需的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及不利于神經(jīng)修復(fù)的微環(huán)境，使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中只有一小部分神經(jīng)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元能夠存活并分化成脊髓損傷移植部位的神經(jīng)元[6]。

神經(jīng)干細(xì)胞除了分化為神經(jīng)元細(xì)胞還分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞后期會(huì)形成致密的膠質(zhì)瘢痕，對(duì)損傷突起再生有機(jī)械性阻礙作用。Y.Liu[12]發(fā)現(xiàn)位于中央管的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷后具有分化為星形細(xì)胞而非神經(jīng)元的趨勢(shì)。但有研究[13]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕并非一無(wú)是處，其可能支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生。王珊等[14]認(rèn)為哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，所形成致密的瘢痕組織會(huì)封鎖傷口從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受進(jìn)一步破壞，這提示神經(jīng)干細(xì)胞可以起到保護(hù)受損脊髓的作用。M.Stenudd[15]證明脊髓損傷后神經(jīng)干細(xì)胞衍生的瘢痕成分可以限制脊髓損傷后的組織損傷和神經(jīng)損失，該發(fā)現(xiàn)將內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞鑒定為治療脊髓損傷的潛在治療靶標(biāo)。故星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元存活、神經(jīng)突觸形成及神經(jīng)元反饋調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用[3]。

2.2神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/生長(zhǎng)因子 脊髓損傷后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/生長(zhǎng)因子可以保護(hù)受損神經(jīng)元，使損傷的細(xì)胞得到修復(fù)。神經(jīng)干細(xì)胞可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等。

BDNF是一種光譜的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可刺激誘導(dǎo)軸突再生抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。宋昭君[16]采用載BDNF基因的陽(yáng)離子超聲微泡(BDNF/CNBs)聯(lián)合超聲靶向破裂技術(shù)(UTMD)治療大鼠脊髓損傷，使大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。NT-3可以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及再生軸突的髓鞘化，促進(jìn)神經(jīng)元的分化、生長(zhǎng)、存活。VEGF是一種多功能生長(zhǎng)因子，參與神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的生長(zhǎng)及成熟的過(guò)程[17]。從幼鼠的脊髓組織中分離出細(xì)胞，在懸浮液中以不同濃度的VEGF的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)20 ng/mL VEGF誘導(dǎo)增長(zhǎng)最快，然后EdU標(biāo)記來(lái)評(píng)估神經(jīng)球中的細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期蛋白D1顯著升高，VEGF可以在體外促進(jìn)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[18]。脊髓損傷后所形成的缺氧條件及細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌有助于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。與正常神經(jīng)干細(xì)胞移植組相比，移植了VNSC的大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元密度高45%，增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放并降低TRPV1的表達(dá)，阻斷TRPV1受體可以減輕疼痛。VEGF-NSC轉(zhuǎn)基因移植導(dǎo)致增強(qiáng)的神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)功能的修復(fù)。VEGF誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞恢復(fù)脊髓損傷后神經(jīng)元的損失，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放[19]。

神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)不同種類(lèi)、不同濃度的因子及多種因子的聯(lián)合應(yīng)用的作用不近相同。F.Liu等[20]實(shí)驗(yàn)表明NGF 、BDNF是維持和分化發(fā)育神經(jīng)元的關(guān)鍵，其中NGF在一定條件下可誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)，對(duì)交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)元的存活和維持至關(guān)重要。與單獨(dú)的BDNF或NGF作用相比，聯(lián)合BDNF和NGF治療誘導(dǎo)更多神經(jīng)元。I.U.Khan[21]將BDNF和血紅素氧合酶-1(HO-1)表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)注射到脊髓損傷的犬上，聯(lián)合治療組顯示犬的后肢功能顯著改善，炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素-6，環(huán)氧合酶-2的表達(dá)減少以及星形膠質(zhì)細(xì)胞減少，脊髓損傷犬的鞘內(nèi)注射HO-1-MSCs后功能恢復(fù)得到改善。相較于HO1-MSCs或BNDF-MSCs組的治療， HO-1和BNDF-MSCs的共同移植治療更能有效的促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)的修復(fù)。脊髓損傷后外源性NGF雖然具有神經(jīng)再生修復(fù)作用,但對(duì)損傷局部再生也存在著抑制作用。

由此可見(jiàn)，不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子聯(lián)合作用更能改善細(xì)胞外環(huán)境，促進(jìn)感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，抑制神經(jīng)元凋亡的作用。

2.3神經(jīng)干細(xì)胞的治療的實(shí)驗(yàn)研究 神經(jīng)干細(xì)胞移植不僅能取代損傷壞死神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)軸突的髓鞘再生或分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，還可以改善損傷區(qū)域的微環(huán)境，抑制炎性反應(yīng)及瘢痕組織形成，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[22]。含有神經(jīng)干細(xì)胞和各種生長(zhǎng)因子的纖維蛋白基質(zhì)的移植顯著增強(qiáng)了脊髓損傷模型中的移植物存活率，并且移植物衍生的神經(jīng)元因此獲得了長(zhǎng)距離軸突生長(zhǎng)并部分恢復(fù)了破壞的神經(jīng)回路，增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌，抗氧化，抗炎和抗凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生[23]。

神經(jīng)干細(xì)胞移植替代壞死神經(jīng)元成為實(shí)驗(yàn)研究治療脊髓損傷的方法之一。K.Z.Lee[24]在研究證實(shí)嚙齒動(dòng)物移植的神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元分化可使神經(jīng)干細(xì)胞部分恢復(fù)。有研究[25]將脊髓損傷小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞移植到受損脊髓中，隨后進(jìn)行中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫熒光染色和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)的mRNA水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NSC移植可通過(guò)減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞活化和浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)脊髓損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并增強(qiáng)脊髓損傷后的神經(jīng)功能。臨床上可用于緩解繼發(fā)性脊髓損傷的米諾環(huán)素長(zhǎng)期服用存在毒性，X.J.Wang[26]開(kāi)發(fā)的基于聚唾液酸(PSA)的米諾環(huán)素負(fù)載納米藥物輸送系統(tǒng)(PSM)在脊髓損傷的大鼠上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可改善大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，減少神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成，從而促進(jìn)神經(jīng)元的再生和長(zhǎng)軸突在整個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕中延伸，保護(hù)神經(jīng)元和髓鞘免受損傷。

以生物工程材料為代表的神經(jīng)支架可以填補(bǔ)缺陷并重現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)成為替代材料首選。膠原支架具有良好的生物相容性和生物降解性，B.Fan等[27]將支架植入脊髓損傷大鼠病變區(qū)發(fā)現(xiàn)其可以減少疤痕沉積，促進(jìn)神經(jīng)生成，促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。使用iPSC-NP治療急性脊髓損傷對(duì)脊髓再生中涉及的大多數(shù)研究因素產(chǎn)生了積極的影響，如神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成，軸突發(fā)芽，組織保留和細(xì)胞因子水平。將iPSC-NP-LHM細(xì)胞—聚合物構(gòu)建體植入慢性脊髓損傷導(dǎo)致材料整合到受損脊髓中，影響橋接腔中內(nèi)源組織元素的浸潤(rùn)，而且還增加受損區(qū)域以及周?chē)拗鹘M織中TH+軸突的萌發(fā)。iPSC-NPs在支架中存活，影響了內(nèi)源TH+神經(jīng)元的數(shù)量與星形膠質(zhì)細(xì)胞緊密連通[28]。在細(xì)胞替代的探索中，N.Chen[29]將亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白LINGO-1RNA移植到脊髓損傷大鼠模型上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINGO-1 RNA處理的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植增加。

盡管神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷治療有很大的希望，但為了在功能上重建受損的神經(jīng)回路，有必要將細(xì)胞替代療法與其他治療策略(雞尾酒療法)相結(jié)合。軸突再生是脊髓損傷修復(fù)的前提，有研究[30]將表達(dá)綠色熒光蛋白的神經(jīng)干細(xì)胞包埋于含生長(zhǎng)因子雞尾酒的纖維蛋白基質(zhì)中，移植至脊髓損傷部位，發(fā)現(xiàn)其可以延伸出大量軸突。用纖維蛋白改變病變微環(huán)境后嵌入生長(zhǎng)因子雞尾酒的矩陣觀察到移植的神經(jīng)干細(xì)胞分化成多種類(lèi)型的神經(jīng)元，最終可促進(jìn)嚴(yán)重脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能改善。

3 小 結(jié)

脊髓損傷可導(dǎo)致軸突斷裂和神經(jīng)元死亡，造成患者的永久性功能障礙。盡管神經(jīng)干細(xì)胞的移植、替代及生物支架在脊髓損傷修復(fù)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究方面取得了重要進(jìn)展，促進(jìn)了損傷后微環(huán)境的改善及神經(jīng)因子的修復(fù)，神經(jīng)功能的恢復(fù)[31]，但是在脊髓損傷后神經(jīng)元的功能不可能完全恢復(fù)是既定事實(shí)。(1)神經(jīng)干細(xì)胞治療脊髓損傷存在兩大難點(diǎn)：①在抑制瘢痕組織形成的同時(shí)誘導(dǎo)促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)；②預(yù)防神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)繼發(fā)性死亡[32]。當(dāng)前人們?cè)谏窠?jīng)干細(xì)胞領(lǐng)域探索大多圍繞細(xì)胞移植及替代治療，在脊髓損傷領(lǐng)域除了神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)脊髓刺激(SCS)弱施加的DC電場(chǎng)，也可促進(jìn)神經(jīng)突雙向再生。盡管許多新型治療方法在脊髓損傷實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型中顯示出前景，但這些實(shí)驗(yàn)所模仿的脊髓損傷與患者的實(shí)際情況仍存在差距。(2)目前在脊髓損傷領(lǐng)域所探討的神經(jīng)干細(xì)胞大都是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而有研究[33]報(bào)道指出中樞神經(jīng)系統(tǒng)不具備與周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)相同的再生能力，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。長(zhǎng)期受傷的神經(jīng)組織環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的存活，生長(zhǎng)和分化是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。在體外用細(xì)胞穩(wěn)定填充的支架不一定用作體內(nèi)不利環(huán)境的理想細(xì)胞載體。盡管在脊髓損傷修復(fù)領(lǐng)域的最新進(jìn)展已經(jīng)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有更多的固有再生能力但中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否具備與周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的再生能力仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。(3)體外生長(zhǎng)并不能反映體內(nèi)情況，J.Ruzicka[28]將IPS衍生是神經(jīng)干細(xì)胞接種于LHM水凝膠上，在整個(gè)研究期間，LHM水凝膠支持材料中細(xì)胞可以粘附生長(zhǎng)，然而細(xì)胞仍然不成熟。說(shuō)明支架應(yīng)用于脊髓損傷的修復(fù)領(lǐng)域仍需要更多的探索。雖然支架的整合和移植細(xì)胞的神經(jīng)分化不能導(dǎo)致功能恢復(fù)，但它可以改變慢性脊髓損傷的微環(huán)境并可能使重要的生理功能恢復(fù)。(4)在開(kāi)發(fā)細(xì)胞移植療法治療脊髓損傷時(shí)安全性是進(jìn)一步的重要考慮因素，另外需要解決其取材及體外培養(yǎng)的難題。

總之，神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷的神經(jīng)修復(fù)是人類(lèi)治療脊髓損傷的希望，雖然神經(jīng)干細(xì)胞的作用機(jī)制已經(jīng)明確，但當(dāng)其應(yīng)用于脊髓損傷領(lǐng)域尚存在許多問(wèn)題急需研究解決。