纖毛在心臟發(fā)育和先天性心臟病中的作用及機制

徐嘉琪，楊 雷，申 婕，陳淳媛，曾志輝，歐陽喆深，趙明一

1中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，長沙 410013 2湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，長沙 410000

先天性心臟疾病(congenital heart disease，CHD)是由心血管發(fā)育異常引起的結(jié)構(gòu)性先天缺陷，主要表現(xiàn)為心腔與流出道空間結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，是最常見的先天性缺陷之一，約占活產(chǎn)新生兒的1%[1]，也是導(dǎo)致5歲以下兒童非感染性死亡最常見原因[2]。CHD發(fā)病機制很復(fù)雜，是由遺傳和環(huán)境因素共同驅(qū)動的，目前其遺傳學(xué)病因尚不清楚，可能與染色體異常[3]及拷貝數(shù)變異[4]高度相關(guān)。近年來有學(xué)者提出觀點，認(rèn)為纖毛可作為遺傳因素，在調(diào)節(jié)心血管發(fā)育和CHD致病中發(fā)揮重要作用。纖毛是位于細(xì)胞表面高度保守的細(xì)胞器，幾乎存在于人體的所有極性細(xì)胞表面，具有運動、感知、傳導(dǎo)信號、調(diào)控細(xì)胞周期等作用。與纖毛功能失調(diào)相關(guān)的發(fā)育缺陷和多種疾病反映了該細(xì)胞器在整個生命過程中功能的復(fù)雜性和重要性，更重要的是，在幾種纖毛病綜合征中觀察到了心臟發(fā)育缺陷，包括Alstr?m綜合征(Alstro?s syndrome，ALMS)、Bardet-Biedl綜合征(Bardet-Biedl syndrome，BBS)、Meckel綜合征(Meckel syndrome，MKS)、Dandy-Walker綜合征(Dandy-Walker，DWS)、Joubert綜合征(Joubert syndrome，JBTS)、Ellis-van Creveld綜合征(Ellis-van Creveld syndrome，EVCS)、McKusick-Kaufman綜合征(McKusick-Kaufman syndrome，MKKS)和短肋-多指綜合征(short rib-polydactyly syndrome，SRPS)等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，心臟祖細(xì)胞表面具有運動功能的纖毛與細(xì)胞的遷移、心管環(huán)化、心臟腔室形成有關(guān)，提示CHD可能是一類新的纖毛病。

纖毛的結(jié)構(gòu)

纖毛是細(xì)胞表面的突起狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，中心由1個軸絲組成，軸絲從細(xì)胞表面的基體突出，整體被胞質(zhì)的基質(zhì)和特殊的睫狀膜包圍。纖毛的軸絲包含9組外周二聯(lián)微管，部分纖毛的外周微管中央還包圍著1對中心微管。軸絲從基體部位開始組裝，完成組裝的軸絲其微管束的表面附著有輻條蛋白、連接蛋白及內(nèi)外動力蛋白臂，在基體頂端到中心微管基部的過渡區(qū)分布著大量纖毛相關(guān)蛋白[5- 7]。

目前對于纖毛的分類沒有明確標(biāo)準(zhǔn)，但大多數(shù)觀點認(rèn)為，纖毛因微管蛋白的組成結(jié)構(gòu)和數(shù)量不同而分為運動纖毛和感覺纖毛兩類，其中，感覺纖毛又稱非運動纖毛或初級纖毛[5]。運動纖毛的外圍9組微管中央包圍著1對微管，成9+2型；而初級纖毛則缺少中央的1對微管，成9+0型。運動纖毛由1個睫狀膜結(jié)合的微管細(xì)胞絲構(gòu)成，軸絲由微管蛋白亞基構(gòu)建，并通過滑絲機制產(chǎn)生細(xì)胞推動力。運動纖毛參與人體多個生理機能過程，包括上下呼吸道黏液清除、腦脊液的流動及生殖系統(tǒng)的精卵運輸?shù)?。此外，一種定位于胚胎結(jié)的胚胎Nodal纖毛在發(fā)育胚胎的左右不對稱形態(tài)建立過程中發(fā)揮重要作用，Nodal纖毛是一種特殊類型的運動纖毛，但Nodal不同于其他運動纖毛，它缺少中央的1對微管和輻條，因此也成9+0型，但可產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)運動從而引導(dǎo)細(xì)胞外液的向左流動。值得注意的是，它僅在胚胎發(fā)育期間的原腸胚腹側(cè)節(jié)點中短暫存在，所以Nodal纖毛又稱為節(jié)點纖毛[8]。初級纖毛是一種調(diào)節(jié)多種不同信號通路的有感受功能的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在機體發(fā)育和組織穩(wěn)定過程中調(diào)控細(xì)胞的活動，參與多種器官的發(fā)生[9]。研究發(fā)現(xiàn)，初級纖毛存在于心肌細(xì)胞形成的各個階段，包括前體細(xì)胞、胚胎心肌細(xì)胞、成熟心臟組織中的心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞及瓣膜間充質(zhì)細(xì)胞中[10]，并且隨著間充質(zhì)細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，初級纖毛也會消失。不同類型的纖毛因結(jié)構(gòu)及蛋白組成不同而具有各自特殊的功能：(1)運動性能(運動纖毛)；(2)感覺性能(初級纖毛)；(3)依賴信號通路控制細(xì)胞生理活動(初級纖毛和Nodal纖毛)；(4)調(diào)控胚胎發(fā)育(運動纖毛和初級纖毛)[11- 13]。

纖毛的形成離不開鞭毛內(nèi)運輸(intraflagellar transport，IFT)系統(tǒng)[14]。由于纖毛內(nèi)沒有蛋白質(zhì)合成所必需的結(jié)構(gòu)，所以在細(xì)胞體中鞭毛軸絲(axoneme)蛋白的合成位點與裝配位點相去甚遠(yuǎn)，將axoneme蛋白從合成部位運輸?shù)嚼w毛軸絲底部則是IFT系統(tǒng)的功能之一，也是纖毛組裝的第1步。除此之外，IFT系統(tǒng)的主要功能是負(fù)責(zé)纖毛軸絲的解聚和組裝。IFT運輸?shù)鞍讛y帶用于組裝和維護纖毛軸及纖毛膜的原料顆粒，沿著纖毛膜下的軸突微管從底部到頂端不斷地移動，當(dāng)IFT運輸?shù)鞍椎竭_(dá)纖毛的頂端釋放原料顆粒后開始反方向運輸，被送回纖毛的底部，進行IFT的再次組裝，如此反復(fù)，維持纖毛的正常結(jié)構(gòu)和功能[5，14- 15]。

心臟的發(fā)育過程

在脊椎動物中，心臟是胚胎發(fā)育過程中首先形成的器官，它起源于中胚層的心原基，經(jīng)歷心管的形成、環(huán)化及房室形成等過程，最終發(fā)育為完整心臟結(jié)構(gòu)。胚胎形成的第2周以后，中胚層心原基開始特化為心臟祖細(xì)胞，包括第一心域(first heart field，F(xiàn)HF)細(xì)胞和第二心域(second heart field，SHF)細(xì)胞，形成1對心管，這就是心臟最原始的結(jié)構(gòu)。原始心管位于胚胎的頭端，隨著胚胎的發(fā)育和翻折，心管會從頭端翻折至前腸的腹側(cè)(胚胎發(fā)育為個體時的胸部)，心管在此處繼續(xù)生長，并發(fā)生不對稱環(huán)化，即不同部位的心管發(fā)生膨脹、縮窄、扭曲和折疊，形成心球、心房、心室和靜脈竇等早期心臟結(jié)構(gòu)。在出生前發(fā)育的第4周左右，原始心臟開始出現(xiàn)跳動，并伴隨血液流動。大概在第4周末出現(xiàn)房室分隔，逐步形成左右不對稱的房室腔[16]。

心臟發(fā)育是個極其復(fù)雜的過程，心臟祖細(xì)胞除了形成不同功能的心臟細(xì)胞外，其表面的心臟初級纖毛也參與心臟的環(huán)化和左右不對稱形成過程，是胚胎期心管發(fā)育為四腔室心臟結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，同時也是多個信號通路的重要組成部分。其中Hedgehog(Hh)信號通路、Wnt/平面細(xì)胞極性(planar cell polarity，PCP)信號通路、β型轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)/骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號通路及α型血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor α，PDGFRα)信號通路均依賴?yán)w毛發(fā)揮各自重要的生理調(diào)控功能。

纖毛是體內(nèi)多個信號通路的組成成員

Hh信號通路在Hh信號通路中，效應(yīng)器Smo位于纖毛膜，在通路中發(fā)揮傳遞信號的功能。轉(zhuǎn)錄因子Gli家族則依賴于纖毛膜下的IFT系統(tǒng)發(fā)揮運輸功能。Hh基因是首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的體節(jié)極性基因，在果蠅和哺乳動物中均具有較高的保守性，其編碼的信號蛋白主要參與調(diào)控胚胎發(fā)育和器官形成。在高等脊椎動物中，Hh基因家族有3個成員：Sonic Hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)，分別編碼SHH、IHH和DHH 3種蛋白。其中以Shh基因的作用最為廣泛，主要調(diào)控早期胚胎發(fā)育，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、體節(jié)背腹模式、器官形成及左右不對稱發(fā)育等過程密切相關(guān)。Hh信號通路包括5大核心原件：配體(Shh、Ihh和Dhh)、受體Patched(Ptc)、效應(yīng)器Smoothened(Smo)、轉(zhuǎn)錄因子Gli家族及校正器suppressor of fu(Sufu)[17]。這些核心原件均定位于初級纖毛，Hh配體與受體Ptc結(jié)合，形成復(fù)合體存在于纖毛膜表面，并激活Smo進入纖毛膜內(nèi)，Smo從Sufu中分離出Gli2和Gli3蛋白，使它們轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄激活子并入核調(diào)節(jié)核內(nèi)基因表達(dá)(圖1)。動力蛋白、驅(qū)動蛋白以及IFT都參與了該信號蛋白在纖毛膜上的運輸。其中，Ptc、Smo、Gli的運輸均依賴于IFT系統(tǒng)(以IFT27和IFT25蛋白為主)。Gli家族在脊椎動物胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用，而纖毛調(diào)節(jié)的蛋白酶體是Gli反應(yīng)過程所必需的[18- 19]。因此Hh信號通路的正常維持離不開完整的初級纖毛結(jié)構(gòu)，而纖毛調(diào)控機體發(fā)育又是通過Hh信號通路來實現(xiàn)的，兩者相輔相成，共同調(diào)節(jié)。

Hh信號通路是目前描述較為完善的纖毛轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號通路。在心臟發(fā)育過程中，Shh表達(dá)于咽內(nèi)胚層和前內(nèi)胚層，除去纖毛會導(dǎo)致Shh信號的急劇減少，研究發(fā)現(xiàn)基因敲除的小鼠胚胎會表現(xiàn)出多種心臟缺陷，如：房間隔缺陷、房室間隔缺陷、心管流出道(outflow tract，OFT)分隔缺陷及異常咽動脈弓發(fā)育等[20]?？梢?，Hh信號對胚胎心臟的房室形成舉足輕重，通路中的任何缺失或異常都能導(dǎo)致房室分隔缺陷的發(fā)生[21]。

Wnt/PCP信號通路Wnt信號通路是已經(jīng)被證實的參與調(diào)控心臟發(fā)育的重要通路，分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩個通路。同樣地，部分Wnt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)也依賴于纖毛，其中被稱為非經(jīng)典Wnt信號的Wnt/PCP信號通路與纖毛關(guān)系密切。其通路中的部分蛋白質(zhì)定位于纖毛或其基體上(如效應(yīng)蛋白Inversin定位于基體)，纖毛功能異常或缺失將會抑制或阻斷該信號通路(圖1)。相反地，部分纖毛的蛋白需與Wnt/PCP信號通路的蛋白相互結(jié)合才能發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)纖毛的定位和微管裝配，并決定纖毛的極性分布[22]。

Wnt/PCP信號通路的靶基因被分為核心基因和效應(yīng)基因。此通路主要通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，決定組織器官的形態(tài)學(xué)特征[23]；也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中微絲肌動蛋白的聚合與解離，影響細(xì)胞平面極性及紡錘體的定位。阻斷Wnt/PCP通路會引起IFT系統(tǒng)功能缺陷，隨之阻礙纖毛軸絲的組裝，最終纖毛長度受限，功能異常。有研究發(fā)現(xiàn)，PCP組分蛋白Wdpcp和PK1發(fā)生突變后，胚胎會出現(xiàn)細(xì)胞極性和細(xì)胞遷移障礙，這都反映了非經(jīng)典Wnt/PCP信號通路在調(diào)節(jié)心臟發(fā)育中的重要作用[24]。

TGF-β/BMP信號通路TGF-β超家族是一類由結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽生長因子亞家族組成的生長因子，在心臟發(fā)育的初始及環(huán)化階段發(fā)揮重要調(diào)控作用，其中以Nodal信號通路最具代表性。Nodal信號通路通過配體-受體結(jié)合的方式傳導(dǎo)信號，在表皮生長因子-CFC1(epidermal growth factor-Cripto- 1/FRL1/cryptic，EGF-CFC1)及左右決定因子1或2(Lefty1/2)等蛋白的協(xié)助下，配體Nodal及生長分化因子- 1(growth differentiation factor- 1，GDF- 1)與Nodal受體[包括活化素受體樣激酶，比如 Alk受體(Alk4和Alk7)；活化素受體，比如ActR Ⅱ受體(ActR Ⅱ a和ActR Ⅱ b)]結(jié)合，激活Nodal信號通路，并將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Smad家族和叉頭蛋白H1(Foxhl)，進而通過調(diào)控靶基因Nodal及其下游因子的表達(dá)來調(diào)控心臟發(fā)育。Nodal信號通路主要調(diào)控內(nèi)臟的不對稱發(fā)育，以心臟結(jié)構(gòu)發(fā)育為主要調(diào)節(jié)對象。通路中的每單個因子如若發(fā)生缺失或突變，均會產(chǎn)生器官發(fā)育異常(圖1)[25]。人類Nodal和Lefty2基因突變會導(dǎo)致內(nèi)臟異位和CHD。研究發(fā)現(xiàn)，咽內(nèi)胚層和外胚層在主動脈弓和OFT的發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用，并介導(dǎo)心內(nèi)膜上皮-間質(zhì)的動態(tài)轉(zhuǎn)換過程(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，促進具有早期瓣膜功能的心內(nèi)膜墊組織的形成，這些心內(nèi)膜墊組織隨后重塑形成半月瓣和房室瓣成熟小葉，而TGF-β信號參與此過程，調(diào)節(jié)心內(nèi)膜墊EMT的形成及正常OFT的分離等心臟發(fā)育歷程[26]。TGF-β/BMP信號異常很可能在瓣膜缺陷產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，一些隱藏的突變會通過破壞網(wǎng)格蛋白的胞吞作用，或者影響內(nèi)吞受體的循環(huán)，導(dǎo)致心臟瓣膜發(fā)育缺陷。此外，人TGFBR2基因缺失和Smad6基因突變會導(dǎo)致內(nèi)臟異位，Smad12基因突變會引起瓣膜缺陷[27]。

PDGFRα信號通路及其他血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)信號受一系列RTK酶聯(lián)配體調(diào)節(jié)(圖1)，其PDGFRα定位于初級纖毛。研究發(fā)現(xiàn)，PDFGRα突變或缺失的小鼠模型在胎兒期就發(fā)生死亡，解剖發(fā)現(xiàn)此類小鼠存在心臟缺陷[28]。

除了上述與纖毛密切相關(guān)的4個信號通路外，Qian等[29]在斑馬魚動物模型研究中發(fā)現(xiàn)enc1l基因是成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GF)信號通路的下游效應(yīng)因子，并證明了enc1l基因在Kupffer’s囊泡(KV)中表達(dá)，直接參與調(diào)控甚至決定KV纖毛的發(fā)生，敲除enc1l基因會影響KV纖毛的數(shù)量和長度，最終影響斑馬魚心臟發(fā)育的左右不對稱性。

纖毛異常影響心臟發(fā)育

纖毛影響心臟左右不對稱發(fā)育在哺乳動物中，心血管系統(tǒng)復(fù)雜的左右不對稱解剖結(jié)構(gòu)是通過胚胎期不同細(xì)胞群體的高度協(xié)調(diào)及遷移來實現(xiàn)的，這種左右不對稱性是保證機體血氧充足的必備因素，而纖毛在心臟左右不對稱發(fā)育中意義重大。在原腸胚的形成過程中，運動纖毛和初級纖毛在機體左右不對稱的建立及心臟循環(huán)的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。不同類型的纖毛以不同的時空方式調(diào)控心臟發(fā)育的進程，最初，在小鼠的E8階段，節(jié)點周圍冠細(xì)胞上的初級纖毛和節(jié)點中心的Nodal纖毛是產(chǎn)生胚胎左右不對稱和正確心臟環(huán)化方向所必需的[16]。在心臟發(fā)育的后期階段，初級纖毛可以協(xié)調(diào)對于心臟組織形態(tài)發(fā)生和成熟很重要的信號傳導(dǎo)途徑。因此，Nodal纖毛和初級纖毛的組裝或功能缺陷可能導(dǎo)致CHD。

初始形成左右不對稱性的過程與中內(nèi)胚層的左右機化中心(left-right organizer，LRO)信號有關(guān)，而Nodal纖毛則存在于LRO中。LRO信號的產(chǎn)生與平板細(xì)胞極性(planar cell polarity，PCP)機制有關(guān)，在背腹軸、前后軸確定后形成的胚胎結(jié)中，Nodal纖毛同步旋轉(zhuǎn)后形成1個左向的胚胎Nodal液流，Nodal液流通過激活Nodal級聯(lián)信號從而在決定偏側(cè)不對稱性發(fā)育中起作用[30]。Nodal信號通路中的兩個關(guān)鍵因子 Lefty1、Lefty2及轉(zhuǎn)錄因子Pitx2都是在側(cè)板中胚層表達(dá)的，Lefty蛋白隨液流在左側(cè)富集，并抑制右側(cè)Nodal的產(chǎn)生[31- 32]。同時，Nodal在胚胎左側(cè)積累，引起左側(cè)Pitx2的特異性表達(dá)，并形成左右不對稱發(fā)育。這是只在胚胎左側(cè)活躍的Nodal-Pitx2級聯(lián)信號[33]。

雙纖毛模型解釋了Nodal液流是如何調(diào)節(jié)Nodal信號和左右不對稱發(fā)育的。位于胚胎結(jié)中心的運動纖毛產(chǎn)生左向Nodal液流，外圍的初級纖毛則感知胚胎液流產(chǎn)生的機械力及信號因子，然后調(diào)控心臟的左右不對稱發(fā)育[34]。

對于Ca2+信號是否參與了初級纖毛對Nodal液流的感知過程沒有定論，其具體機制還有待研究。但是Ca2+信號不出現(xiàn)在胚胎結(jié)的冠狀細(xì)胞中，推測內(nèi)胚層中的Ca2+信號可能是通過胚胎結(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)至側(cè)板中胚層的[30]。但也有研究認(rèn)為初級纖毛的機械感知功能可能并不是通過Ca2+信號實現(xiàn)的[35]。

圖1與纖毛相關(guān)的信號通路示意圖
Fig1Four primary signaling pathways in cilia

纖毛與CHD研究者對患有CHD的胚胎鼠進行基因篩查，運用ENU化學(xué)誘導(dǎo)突變的方法篩選了218個CHD小鼠模型，用全外顯子組測序鑒定了61個基因中的91個隱性CHD突變，包括34個纖毛基因(22個運動纖毛相關(guān)，12個初級纖毛相關(guān))、16個纖毛參與的信號通路基因及10個囊泡運輸基因，發(fā)現(xiàn)以上突變的基因均與纖毛及纖毛轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞信號通路相關(guān)，從而證明纖毛在調(diào)節(jié)心血管發(fā)育和CHD致病中起重要作用[36]。同樣，對人類CHD患者進行外顯子分析后，發(fā)現(xiàn)近一半的突變位點與纖毛轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞信號通路相關(guān)[37]。

Klena等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CHD患者的基因突變位點與多種人類纖毛疾病的基因缺陷相近，不同纖毛基因的突變可能會有不同程度的CHD表型，并且CHD患者的纖毛基因是多樣復(fù)雜的，CHD可以被看作是一種和纖毛疾病相關(guān)的結(jié)構(gòu)性出生缺陷。因此，構(gòu)建CHD的復(fù)雜基因模型，通過評價纖毛相關(guān)基因突變的結(jié)果來研究纖毛與CHD的關(guān)系將是未來研究方向，也是目前及未來研究的難點。

Garrod等[38]研究發(fā)現(xiàn)，CHD患者中有較高的纖毛異常發(fā)病率(42%)，而伴有內(nèi)臟異位的CHD患者具有更高的風(fēng)險患原發(fā)性纖毛運動障礙(primary ciliary dyskinesia，PCD)相關(guān)的呼吸道疾病，這是一種常染色體隱性遺傳纖毛病。50%的PCD患者存在偏側(cè)發(fā)育缺陷，3.5%～6.0%的患者會出現(xiàn)心血管系統(tǒng)異常，2.6%的患者有復(fù)雜的心血管缺陷。PCD小鼠患CHD的風(fēng)險也明顯高于非PCD小鼠[39]。

結(jié) 語

CHD是最常見的結(jié)構(gòu)性出生缺陷，盡管其發(fā)病率很高，但CHD的遺傳及發(fā)病機制仍不明確。對CHD胚胎鼠進行基因篩查結(jié)果揭示了纖毛相關(guān)基因在CHD發(fā)病機制中的核心作用[36]。這些研究表明纖毛和纖毛轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞信號通路的紊亂可能在CHD的發(fā)病機制中舉足輕重。值得注意的是，在臨床上CHD患者發(fā)生纖毛功能障礙的比例高于普通人，并且其纖毛和纖毛相關(guān)通路中的新發(fā)致病突變位點也較普通人群高[38]，這不僅進一步證實了纖毛在CHD中的重要地位，同時也為臨床治療CHD患者提供了新思路：從分子水平對CHD患者進行分層，建立臨床路徑，從而優(yōu)化患者的臨床管理，提高臨床治療效果。此外，有研究者在動脈粥樣硬化患者的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了初級纖毛，提示初級纖毛可能在成人心臟疾病中具有潛在作用[40]。因此，今后需要做更多的工作來闡明纖毛生物學(xué)在人類冠心病及其他心血管疾病中的作用，為心血管疾病的治療性干預(yù)提供新的思路，為CHD的產(chǎn)前篩查提供更準(zhǔn)確的方法，最終改善心臟病患者的預(yù)后。