牛膝中皂苷和甾酮類物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理活性研究進(jìn)展△

羅懿釩，歐陽(yáng)文，唐代鳳，程思佳，唐純玉，張?jiān)评ぃ跣埤?，周華榮，李順祥*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南時(shí)代陽(yáng)光藥業(yè)股份有限公司，湖南 永州 410116；4. 湖南省抗感染中藥工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 410116；5. 湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

牛膝有懷牛膝、川牛膝和土牛膝之分。懷牛膝是莧科植物牛膝AchyranthesbidentataBl.的干燥根；川牛膝是莧科植物川牛膝CyathulaofficinalisKuan的干燥根；土牛膝是莧科植物牛膝A.bidentataBl.的野生種粗毛牛膝A.asperaL.及柳葉牛膝A.longifoliaMakino等的根及根莖[1-2]。來(lái)源不同，功效及臨床應(yīng)用也有較大差異。懷牛膝逐瘀通經(jīng)、利尿通淋、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；川牛膝逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋；土牛膝有活血散瘀、清熱解毒、利尿之功效[2]。牛膝的應(yīng)用在我國(guó)具有悠久的歷史，《本草綱目》對(duì)其有詳細(xì)的描述。牛膝的藥用價(jià)值與其本身所含有的化學(xué)成分是密不可分的。目前，從牛膝中分離得到的化學(xué)成分主要包括皂苷、甾酮、黃酮、糖、生物堿及有機(jī)酸等成分，其中皂苷類及甾酮類是牛膝的主要化學(xué)成分，同時(shí)也是公認(rèn)的主要活性成分。為了進(jìn)一步開發(fā)和利用牛膝資源，明確該藥的物質(zhì)及藥效基礎(chǔ)，本文從牛膝皂苷類及甾酮類化學(xué)成分、藥理活性及含量測(cè)定3個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 化學(xué)成分

1.1 三萜皂苷類化合物

三萜皂苷類化合物是中藥牛膝中主要的化學(xué)成分，其在懷牛膝、川牛膝和土牛膝中均有發(fā)現(xiàn)，也少見于日本牛膝(莧科植物日本牛膝A.faurieiLév. et.Van的根)。目前分離得到的三萜皂苷類的化學(xué)成分主要是以齊墩果酸為苷元的皂苷類成分，共有39個(gè)化合物(1～39)，其母核結(jié)構(gòu)見圖1，各化合物的名稱、取代基團(tuán)及來(lái)源見表1。

圖1 牛膝中三萜類化學(xué)成分1～39的母核結(jié)構(gòu)

表1 牛膝中三萜及其皂苷類化合物

續(xù)表1

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續(xù)表1

續(xù)表1

1.2 甾酮類化合物

甾酮類被認(rèn)為是牛膝的第二類活性成分，其中懷牛膝主要含牛膝甾酮類化合物，川牛膝含有杯莧甾酮類化合物及其衍生物，目前從土牛膝中分離得到的甾酮類化合物較少。從牛膝中分離得到的甾酮類化合物有31個(gè)，化合物40～70的結(jié)構(gòu)和來(lái)源見表2。

表2 牛膝中甾酮類化合物

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

2 藥理作用

中醫(yī)研究理論認(rèn)為，懷牛膝逐瘀通經(jīng)、利尿通淋、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，主治月經(jīng)不調(diào)、腰膝酸痛、肝腎虧虛等；川牛膝逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋，主治風(fēng)濕痹痛、足痿筋攣、跌撲損傷等；土牛膝活血散瘀、清熱解毒、利尿，主治跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、白喉、咽喉腫痛等。藥理研究表明，懷牛膝具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗生育、抗腫瘤、抗衰老、抗炎及抗骨質(zhì)疏松等藥理作用；川牛膝具有調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗病毒、抗生育、抗腫瘤等藥理作用；土牛膝具有降糖、抗菌、抗病毒及鎮(zhèn)痛抗炎的藥理作用。皂苷及甾酮類化合物是牛膝主要的化學(xué)成分，同樣具有一定的藥理作用，但由于各品種所含的皂苷及甾酮類化學(xué)成分存在差異，可能導(dǎo)致牛膝不同品種藥理作用存在差異。

2.1 抗腫瘤作用

王一飛等[39]采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)牛膝總皂苷的抗腫瘤活性進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛膝總皂苷的濃度升高后，體外實(shí)驗(yàn)對(duì)艾氏腹水癌細(xì)胞的毒副作用逐漸增強(qiáng)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠肉瘤S180腹水性及肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞的抑制率逐漸上升。因此推測(cè)牛膝總皂苷具有抗腫瘤作用。

尚風(fēng)琴[40]將懷牛膝和川牛膝進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，甾酮類化合物表現(xiàn)出抗腫瘤活性，且懷牛膝甾酮類化合物抗腫瘤活性高于川牛膝。

2.2 鎮(zhèn)痛抗炎作用

Li等[41]研究了蛻皮甾酮(1種來(lái)自懷牛膝干燥根的甾酮)對(duì)輻射誘導(dǎo)的口腔黏膜炎的大鼠模型的治療效果，結(jié)果表明，蛻皮甾酮可通過(guò)上調(diào)有絲分裂原活化蛋白激酶(Ras-Raf-ERK)信號(hào)通路加速輻射誘導(dǎo)的口腔黏膜炎大鼠模型的愈合過(guò)程。

Xu等[42]研究了懷牛膝皂苷(ABS)對(duì)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥和凋亡的保護(hù)作用，首次證明了ABS對(duì)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制，可認(rèn)為ABS可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在藥物。

Cao等[43]研究了川牛膝提取物及其有效部位對(duì)急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)及抗炎作用，并對(duì)其進(jìn)行成分分析。結(jié)果表明，川牛膝提取物及其有效部位能顯著降低血液、血漿黏度和體內(nèi)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)等因子的水平；并從川牛膝有效部位鑒定出40個(gè)化合物，主要為蛻皮激素類及皂苷類化合物，其中cyasterone和chikusetsusaponin Ⅳ可明顯抑制體外血栓素A2(TXA2)、內(nèi)皮素(ET)、丙二醛(MDA)、COX-2的水平并提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。說(shuō)明川牛膝提取物及其活性部位對(duì)急性血瘀模型大鼠具有明顯的改善血液流變學(xué)和抗炎作用，其代表性成分cyasterone和chikusetsusaponin Ⅳ在體外具有明顯的抗炎、抗氧化和抗凝血作用。

2.3 抗生育作用

郭勝民等[44]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.12 g·L-1質(zhì)量濃度時(shí)，懷牛膝皂苷A對(duì)不同生理狀態(tài)下的大鼠離體子宮均有明顯興奮作用，但對(duì)幼齡子宮作用最弱，對(duì)晚孕子宮作用最強(qiáng)，對(duì)大鼠宮角平滑肌有明顯興奮作用，對(duì)宮頸興奮不明顯；且通過(guò)在體家兔子宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，局部分別給予0.06、0.12、0.24 g·L-1劑量的懷牛膝皂苷A均有明顯興奮未孕及已孕家兔在體子宮的作用。

王世祥等[45]通過(guò)給小鼠灌服懷牛膝總皂苷，表明懷牛膝總皂苷具有明顯的抗著床、抗早孕作用，且呈劑量依賴性關(guān)系。朱和等[46]]實(shí)驗(yàn)觀察了懷牛膝總皂苷對(duì)大、小鼠的抗生育作用。結(jié)果顯示，小鼠妊娠的第1～10天，灌胃給藥具有顯著的抗生育作用，且呈劑量依賴性關(guān)系；小鼠妊娠的第1～5天，懷牛膝總皂苷500 mg·kg-1灌胃給藥具有明顯的抗著床作用。但對(duì)大鼠250～500 mg·kg-1劑量灌胃給藥時(shí)無(wú)抗生育作用，2 g·kg-1灌胃給藥時(shí)也無(wú)墮胎作用。

2.4 抗骨質(zhì)疏松作用

孫奮勇等[47]制備牛膝含藥血清，醇提法制備牛膝脫皮甾酮，噻唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)兩者對(duì)體外培養(yǎng)的HOFB1.19的促增殖作用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)蛋白激酶A調(diào)節(jié)基Iβ(PKAR Iβ)的表達(dá)。結(jié)果顯示，牛膝含藥血清與牛膝蛻皮甾酮均能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，并導(dǎo)致PKAR Iβ表達(dá)的上調(diào)，可初步判定牛膝在體外有促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖的作用，其主要成分是蛻皮甾酮，并可能是通過(guò)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行的。

董群偉等[48]研究了牛膝蛻皮甾酮對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用，發(fā)現(xiàn)懷牛膝蛻皮甾酮高、中、低3個(gè)劑量組均有改善骨密度和各項(xiàng)生物力學(xué)及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的作用，表明牛膝蛻皮甾酮對(duì)卵巢大鼠骨質(zhì)疏松具有防治作用，并呈劑量依賴性。

任心慈等[49]研究了懷牛膝總皂苷對(duì)維甲酸所致骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)懷牛膝總皂苷可升高骨質(zhì)疏松大鼠血Ca含量、堿性磷酸酶(ALP)活性、血清骨鈣素(BGP)水平以及降低尿中羥脯氨酸水平。結(jié)果表明，牛膝總皂苷可改善患有骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝。

盧清秀[50]通過(guò)體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，建立了大鼠骨質(zhì)疏松模型及骨折模型，確定了懷牛膝甾體組分為治療骨質(zhì)疏松的主要有效性組分。在治療骨折過(guò)程中懷牛膝甾體組分和懷牛膝皂苷組分發(fā)揮了協(xié)同作用，均有治療骨折的作用。

2.5 降糖作用

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，蛻皮甾酮在1×10-6～1×10-4mol·L-1的濃度能增加葡萄糖消耗量，且蛻皮甾酮的降糖效果隨葡萄糖濃度的升高而降低，說(shuō)明蛻皮甾酮降糖作用是通過(guò)干細(xì)胞發(fā)揮作用的。通過(guò)胰島素抵抗細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)蛻皮甾酮在胰島素抵抗細(xì)胞模型中能增加胰島素的敏感性，改善糖代謝[51-52]。

2.6 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用

孟大利[53]對(duì)懷牛膝總甾酮在改善腦功能障礙方面的作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，對(duì)環(huán)己酰亞胺所致小鼠記憶鞏固障礙有顯著的拮抗作用，懷牛膝總甾酮能顯著對(duì)抗東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙；同時(shí)懷牛膝總甾酮能顯著縮短氰化鉀所致的翻正反射消失時(shí)間及再探索時(shí)間，具有顯著的抗缺氧作用。王龍[54]研究發(fā)現(xiàn)，懷牛膝中蛻皮甾酮可通過(guò)抑制腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性，增加腦內(nèi)乙酰膽堿含量，從而對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生積極影響，發(fā)揮增強(qiáng)記憶力作用。

3 含量測(cè)定

衛(wèi)修來(lái)等[55]采用高氯酸-香草醛比色法建立懷牛膝中總皂苷含量的測(cè)定方法，對(duì)5批不同牛膝藥材進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)計(jì)算總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.88%、6.47%、6.05%、5.70%、7.11%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.24%。楊柳等[56]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-蒸發(fā)光檢測(cè)器法(HPLC-DAD-ELSD)同時(shí)測(cè)定懷牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量，結(jié)果測(cè)得10個(gè)不同批次的懷牛膝藥材中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.019～0.963、0.022～4.695、0.047～4.830 mg·g-1。王龍等[57]采用大孔吸附樹脂提取分離牛膝總甾酮，利用紫外分光光度法測(cè)定牛膝總甾酮含量，結(jié)果測(cè)得5批不同樣品的牛膝總甾酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.8%。

尚風(fēng)琴[40]通過(guò)大孔樹脂、十八烷基硅烷鍵合反相硅膠色譜柱(RP-C18)等手段有效地富集其三萜皂苷類及甾酮類化合物，分別建立了懷牛膝和川牛膝皂苷類指紋圖譜和甾酮類指紋圖譜。根據(jù)指紋譜圖提供的信息，懷牛膝和川牛膝總皂苷分別占所有化合物含量的66.5%和52.5%。馬英等[58]用反相高效液相色譜法對(duì)16個(gè)不同產(chǎn)地的川牛膝中所含的杯莧甾酮進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明，各批次川牛膝中杯莧甾酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.47～3.48)×10-2mg·g-1，不同產(chǎn)地的樣品中杯莧甾酮含量不同。

黃志芳等[59]采用薄層色譜法和分光光度法對(duì)土牛膝中的齊墩果酸和多糖進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果齊墩果酸的提取率為0.88%，牛膝多糖的提取率為7.2%。歐麗蘭等[60]采用顯微鑒別、薄層色譜鑒別和HPLC對(duì)土牛膝進(jìn)行定性和定量鑒定，測(cè)得土牛膝中齊墩果酸和蛻皮甾酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.445 3%和0.103 3%。柳立新等[61]采用比色法測(cè)定甲醇回流提取、乙醇回流提取、水超聲提取、乙醇超聲提取及索氏回流提取制備的樣品溶液中總皂苷含量，結(jié)果表明，樣品溶液中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.36%、4.75%、2.63%、4.97%、2.14%。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

本文綜述了懷牛膝、川牛膝和土牛膝皂苷類及甾酮類化學(xué)成分、藥理活性及含量測(cè)定的概況。迄今為止國(guó)內(nèi)外研究人員已從中分離得到了大量皂苷類、甾酮類等化合物，部分黃酮類、糖苷類、生物堿類及脂肪酸等化合物。懷牛膝、川牛膝和土牛膝在化學(xué)成分和藥理作用方面均存在差異，且皂苷及甾酮類含量均有不同，臨床上應(yīng)規(guī)范應(yīng)用，以保證療效及安全。牛膝的藥理作用廣泛，有關(guān)牛膝的藥理研究也更多停留在牛膝粗提物或其個(gè)別化合物上，且有關(guān)藥理藥效機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道不全面，可更加深入地開展其單體化合物的藥效機(jī)制研究及臨床應(yīng)用方面的研究，有效利用牛膝的藥用價(jià)值。

不同來(lái)源之間的牛膝化學(xué)成分也存在較大差異，懷牛膝含齊墩果酸型三萜皂苷及蛻皮甾酮、牛膝甾酮等化合物，川牛膝主要含皂苷、阿魏酸及大量甾酮類化合物，土牛膝含齊墩果酸型皂苷及昆蟲變態(tài)激素蛻皮甾酮，其功效不同可能受化學(xué)成分差異的影響。且目前文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在懷牛膝和川牛膝等方面，關(guān)于土牛膝的化學(xué)成分的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，近5年有關(guān)牛膝的文獻(xiàn)報(bào)道也相對(duì)缺乏。

目前，本團(tuán)隊(duì)對(duì)土牛膝各極性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)各極性部位及分離得到的化學(xué)成分進(jìn)行體外抗炎活性篩選，以期更充分研究土牛膝的化學(xué)成分及其藥理作用。近年從粗毛牛膝首次分離得到了包括吲哚類生物堿、新異黃酮類等新結(jié)構(gòu)類型化合物，這些化合物與土牛膝清熱解毒的藥效是否有聯(lián)系，或者該植物是否還有更多更新穎化學(xué)成分，均值得進(jìn)一步深入探討研究。