不同產(chǎn)地百合藥材化學成分與氣候因子的相關(guān)性研究△

謝景，唐雪陽，郝婧，鐘燦，劉浩，黃建華*，張水寒，唐正平，3

1.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，湖南 長沙 410013；2.湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；3.湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，湖南 瀏陽 410331

百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神功效，是湖南省重要的食用、藥用中藥材，同時也是國家衛(wèi)生部審批通過的第一批藥食兩用資源。我國百合種類約47種，18個變種，占世界百合總數(shù)50%以上，其分布橫跨亞熱帶、暖溫帶、溫帶等氣候型，范圍極廣。《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定，百合藥材為卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker或細葉百合L. pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗片，其中卷丹、百合是百合藥材種植的主要品種[1]。百合藥材種植范圍較廣，不同產(chǎn)地藥材品質(zhì)差異較大[2-5]，特定的生態(tài)氣候環(huán)境是百合藥材形成的重要外在因素，與百合藥材品質(zhì)的形成密切相關(guān)。以往人們對百合藥材研究大多集中于含量測定、藥效研究等方面，對百合藥材的氣候環(huán)境特征及其與主要化學含量的相關(guān)性較少。本研究以百合藥材為對象，采用聚類分析、主成分分析、相關(guān)性計算等統(tǒng)計方法，開展不同產(chǎn)地百合藥材浸出物、總多糖、王百合苷含量與氣候生態(tài)因子的相關(guān)性研究，為百合藥材合理規(guī)劃布局、引種栽培及資源可持續(xù)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A型二極管陣列檢測器、SIL-20A型自動進樣器、柱溫箱；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.1.2試藥 王百合苷C(純度：99.9%，批號：P20D10F106515)、王百合苷E(純度：99.2%，批號：P08J11F107953)、王百合苷B(純度：99.6%，批號：P28S10F99182)均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司)；純凈水(華潤怡寶飲料有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.1.3樣品 從湖南、江西、貴州等省收集百合藥材樣品共25份，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，15批樣品為卷丹LiliumlancifoliumThunb.、10批為百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker。采用手持全球定位系統(tǒng)(GPS)獲取采樣點的海拔、經(jīng)度、緯度信息(見表1)。

表1 百合藥材樣品信息

1.2 方法

1.2.1采樣點氣候因子收集 從中國氣象科學數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)中查詢采樣點近5年(2014—2018年)氣候因子數(shù)據(jù)，包括年平均溫度(℃)、最高氣溫(℃)、平均最低氣溫(℃)、平均最高氣溫(℃)、年平均降水量(mm)、降水量≥0.1 mm日數(shù)(d)、最大日降水量(mm)、平均水氣壓(hPa)、平均相對濕度(%)、日照時數(shù)(h)。

1.2.2化學成分測定 浸出物含量測定按照《中華人民共和國藥典》2020年版水溶性浸出物測定法(通則2201)項的冷浸法測定?？偠嗵呛坎捎谜樟蛩?蒽酮法測定，具體方法見參考文獻[6]。采用HPLC測定王百合苷(王百合苷B、王百合苷C、王百合苷E三者總和)含量，采用Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～2 min，5%～13%A；2～17 min，13%～15%A；17～37 min，15%～20%A；37～42 min，20%～100%A；42～47 min，100%～5%A)；流速：1 mL·min-1，檢測波長：250 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。方法學考察結(jié)果顯示精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析方法

1.2.3.1氣候因子、化學成分間相關(guān)性分析方法 采用主成分分析方法提取氣候因子和化學成分的公因子，并以四次方最大值法(Quartimax)旋轉(zhuǎn)后得到因子載荷量及方差貢獻率。以公因子的得分圖比較產(chǎn)地、樣本間的關(guān)系，以因子載荷量評價各因素間相關(guān)性。因子載荷量的值越大，說明該因子與公因子的相關(guān)性越強，即該因子對公因子的貢獻也越大。

1.2.3.2百合化學成分與氣候因子相關(guān)性分析 采用相關(guān)分析、主成分分析等統(tǒng)計方法，開展25個產(chǎn)地不同品種百合浸出物、總多糖、王百合苷含量與產(chǎn)地氣候因子的相關(guān)分析，分析百合、卷丹品質(zhì)評價指標與生態(tài)因子之間的相關(guān)性，找出關(guān)鍵的氣候因子，解析氣候因子對百合藥材品質(zhì)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合化學成分含量測定結(jié)果和主成分分析

卷丹、百合樣品的浸出物、總多糖、王百合苷含量測定結(jié)果見表2～3，卷丹、百合不同產(chǎn)地間浸出物、總多糖、王百合苷含量差異較大。卷丹浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分數(shù)平均值分別為22.47%、25.76%、0.202%，RSD分別為45.21%、8.61%、46.98%；百合浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分數(shù)平均值分別為25.86%、29.04%、0.131%，RSD分別為37.34%、13.82%、87.07%。百合浸出物、總多糖含量高于卷丹，而王百合苷含量低于卷丹。

表2 15批卷丹藥材浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分數(shù) %

表3 10批百合藥材浸出物、總多糖、王百合苷質(zhì)量分數(shù) %

對25份百合藥材樣品浸出物、總多糖及王百合苷3個化學成分進行主成分分析(見圖1)。橫軸PC1和縱軸PC22個主成分貢獻率累計為82.17%，表明2個主成分能夠充分體現(xiàn)出百合樣品化學成分基本特征和主要信息。由圖1可知，10批百合樣品較為分散，說明不同產(chǎn)地間百合藥材品質(zhì)差異相對較大，百合藥材品質(zhì)受產(chǎn)地因素影響相對較大；15批卷丹樣品更為聚集，說明不同產(chǎn)地間卷丹藥材品質(zhì)差異相對較小，卷丹藥材品質(zhì)受產(chǎn)地因素影響相對較小。

圖1 不同產(chǎn)地百合藥材化學成分主成分分析

2.2 產(chǎn)地氣候生態(tài)環(huán)境因子分析與主成分分析

構(gòu)建百合采樣地氣候特征因子，包括X1：最高氣溫(℃)、X2：年平均降水量(mm)、X3：年平均溫度(℃)、X4：平均水氣壓(hPa)、X5：平均相對濕度(%)、X6：平均最低氣溫(℃)、X7：平均最高氣溫(℃)、X8：降水量≥0.1 mm日數(shù)(d)、X9：日照時數(shù)(h)、X10：最大日降水量(mm)。將溫度、水分、光照3類氣候特征因子數(shù)據(jù)輸入SPSS 16.0軟件，運用Person相關(guān)分析方法，分析百合藥材各產(chǎn)地氣候因子的相關(guān)性(見表4)?？芍?，降水量與平均水氣壓、平均相對濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，平均氣溫與平均水氣壓、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，日照時數(shù)與平均水氣壓、平均相對濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

表4 產(chǎn)地氣候生態(tài)環(huán)境因子相關(guān)性

主成分分析法通過從氣候特征中提取公因子，根據(jù)特征根的大小和每個因子對方差解釋的大小來決定主因子的個數(shù)，通常前3個主成分就能夠體現(xiàn)所有特征的信息。從表5中可知，前3個主成分的累積方差貢獻率達到91.99%，幾乎包含了原有氣候因子的特征信息。進而，利用主成分分析的得分進行作圖來體現(xiàn)各因子間的相似性，見圖2。從圖中可見，百合、卷丹產(chǎn)地氣候因子主成分分析結(jié)果存在較大差異，百合和卷丹產(chǎn)地氣候因子各自聚為一類，而卷丹更為緊湊，百合則相對分散，說明百合受不同產(chǎn)地環(huán)境影響較大，產(chǎn)地氣候環(huán)境要求更高。

表5 主成分分析方差總解釋

圖2 百合氣候因子主成分分析

經(jīng)方差最大旋轉(zhuǎn)后的因子載荷系數(shù)矩陣見表6。因子載荷系數(shù)的值越大，說明該因子與公因子的相關(guān)性越強，該因子在公因子的貢獻也就越大。

表6 各氣候因子的載荷分析結(jié)果

第一公因子中，因子載荷量較大的變量分別是主要與溫度及相關(guān)的因子，包括最高氣溫、平均溫度、平均水氣壓、平均最低氣溫、平均最高氣溫，可見氣候因子中溫度因素是這些因素的主要因素，稱第一共因子為“溫度因子”。

第二、三公因子中，因子載荷較大的變量是與水分及相關(guān)的因子，包括年平均降水量、平均相對濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量。因此，稱第二和第三公因子為“降水因子”。

2.3 百合藥材化學成分與氣候因子相關(guān)性分析

對氣候因子與卷丹浸出物、多糖含量、王百合苷含量的總和進行相關(guān)性分析。從表7中可見，卷丹浸出物、多糖含量與溫度氣候因子最相關(guān)。卷丹多糖含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈現(xiàn)正相關(guān)，r分別為0.458 7、0.464 3、0.391 3、0.539 4；與年平均降水量、平均相對濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量呈負相關(guān)，其中與平均相對濕度達顯著負相關(guān)。卷丹浸出物含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈現(xiàn)負相關(guān)，r為0.309 6、0.549 9、0.546 9、0.577 2，說明氣候環(huán)境溫度越高反而不利于卷丹浸出物含量積累。王百合苷含量與各氣候因子整體呈現(xiàn)正相關(guān)，與降水量相關(guān)性較大。

表7 卷丹浸出物、總多糖、王百合苷與氣候因子相關(guān)性

對氣候因子與百合浸出物、多糖含量、王百合苷含量進行相關(guān)性分析。從表8中可見，百合各成分指標與氣候因子的相關(guān)性與卷丹類似，但是相關(guān)性更顯著。百合總多糖含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈正相關(guān)，r分別為0.635 6、0.503 2、0.485 2、0.926 9；與年平均降水量、平均相對濕度呈負相關(guān)，與卷丹結(jié)果一致。浸出物含量與最高氣溫、平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫呈正相關(guān)，與卷丹結(jié)果相反，r分別為0.666 1、0.964 0、0.998 0、0.610 5。百合王百合苷含量與各氣候因子整體呈現(xiàn)正相關(guān)，結(jié)果與卷丹一致。

表8 百合浸出物、總多糖、王百合苷與氣候因子相關(guān)性

3 討論

不同產(chǎn)地百合和卷丹藥材浸出物、總多糖、王百合苷含量存在較大差異。研究結(jié)果表明，百合浸出物、總多糖含量高于卷丹，王百合苷含量低于卷丹。歷代文獻描述百合“味甘美可食，粉性足，味道甘甜”品質(zhì)較佳[7]，與本研究結(jié)果一致。傳統(tǒng)認為，卷丹“根味頗苦”，與百合相異，文獻報道這種“苦味”可能與皂苷類成分有關(guān)[8]。

產(chǎn)地氣候環(huán)境對卷丹和百合的浸出物、總多糖、王百合苷含量影響均存在顯著差異。溫度因子如最高氣溫、平均溫度、平均水氣壓、平均最低氣溫、平均最高氣溫影響較大，與百合總多糖含量呈正相關(guān)。有文獻報道，在一定溫度范圍內(nèi)，百合類植物除可溶性蛋白含量外其他生理生化指標(包括水溶性糖類)隨處理溫度的升高而逐漸上升，但溫度過高對植物正常生長發(fā)育不利[9]。百合活性成分以糖類等初級代謝產(chǎn)物為主，高溫氣候可能通過提高植物生理生化指標而促進糖類成分積累，提高藥材品質(zhì)。

水分因子如年平均降水量、平均相對濕度、降水量≥0.1 mm日數(shù)、最大日降水量影響次之，總多糖含量與年平均降水量、平均相對濕度呈負相關(guān)。有諸多文獻報道，百合植株適宜在輕度干旱脅迫條件下生長，但嚴重干旱不利于植株生長[10-11]。雨水較多的氣候環(huán)境容易引發(fā)病害，影響植物正常生長發(fā)育造成藥材品質(zhì)下降，這可能是降水量及相關(guān)因子是影響百合品質(zhì)形成的原因所在。

本研究揭示了影響百合藥材浸出物、總多糖、王百合苷含量積累的主要生態(tài)因子是溫度和水分，高溫氣候有利于優(yōu)質(zhì)藥材的形成。傳統(tǒng)認為，湖南邵陽地區(qū)所產(chǎn)百合片形狹長、兩端漸尖、色白肉厚，冠以“龍牙百合”之名，是歷代認為品質(zhì)最佳的百合道地藥材。湖南龍山地區(qū)所產(chǎn)卷丹又稱“龍山百合”，色雪白而略帶苦味，是湖南省百合藥材種植的主流品種[12]，也頗負盛名。湖南地區(qū)6—8月夏季高溫，有利于百合藥材多糖類成分積累，而湖南隆回、龍山地區(qū)海拔相對較高，土壤沙性且病蟲害防治技術(shù)成熟，對“龍牙百合”“龍山百合”品牌的形成提供了外部生態(tài)環(huán)境。在百合種植生產(chǎn)過程中，除要科學考察適宜的種植生態(tài)環(huán)境外，還要有合理科學的種植及產(chǎn)地加工技術(shù)，才能確保生產(chǎn)出道地優(yōu)質(zhì)藥材。