甘草種子攜帶真菌檢測與致病性分析△

徐秀蘭，尚興樸，馬麗娟，蘆鈺，王玉璽，邱艷紅，張海軍，吳萍*

1.北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心，北京 100097；2.中國中藥有限公司，北京 100195；3.河北科技師范學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生物科技系，河北 秦皇島 066004；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，北京 100093

甘草GlycyrrhizauralensisFisch以根和根莖入藥，具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛等功效，能調(diào)和百草，素有“十方九草”之美譽(yù)，是我國市場需求旺盛的中藥[1]。野生甘草多生長于三北地區(qū)[2]，是構(gòu)成我國北方荒漠植被的重要植物，具備生態(tài)和經(jīng)濟(jì)的雙重價值，對環(huán)境資源保護(hù)起著不可替代的作用[3]。甘草不僅廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，其制品甘草浸膏、甘草酸粉鹽等在食品、保健品、化妝品、煙草、輕工等許多行業(yè)也備受青睞，國際市場的需求量日益增長。2016年，我國甘草及制品的進(jìn)口量為2.8萬t，進(jìn)口額達(dá)37 000萬美元[4]。

甘草病害的發(fā)生及危害一直都是影響甘草產(chǎn)量及其品質(zhì)最主要的限制因素。據(jù)報道，目前我國甘草主要病害包括銹病、根腐病、褐斑病、白粉病、猝倒病和立枯病等真菌性病害[5]。種子藥劑處理是提高播種品質(zhì)和防治種傳病害最簡單、經(jīng)濟(jì)有效的方法[6]。本研究旨在對甘草種子進(jìn)行內(nèi)外部攜帶真菌檢測，并對種傳真菌的致病性進(jìn)行測試，為甘草種子藥劑處理預(yù)防種傳病害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(批號：DL114-01，博邁德生物有限公司)；乳酸葡萄糖培養(yǎng)基(aPDA，批號：BCBN5254V，F(xiàn)luka公司)；乳酸(批號：20180312，福晨化學(xué)試劑有限公司)；98%硫酸溶液(批號：20160318，光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。

Centrifuge 5424 R型高速離心機(jī)、Centrifuge 5810 R型高速離心機(jī)、MLX-204型瞬時離心機(jī)(Eppendorf中國有限公司)；XT5408-GC380TL2型光照培養(yǎng)箱(杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司)；T110型PCR儀(Bio-Rad公司)；LDZF-50KB型滅菌鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；ShockMixer-1型脈沖震蕩樣品前處理器(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

4個批次來自不同產(chǎn)區(qū)的甘草種子樣品，未經(jīng)任何加工處理于常溫下在編織袋中保存。樣品為中國中藥有限公司提供，由中國中藥有限公司王繼永研究員鑒定為GlycyrrhizauralensisFisch的種子。4個批次的種子均收獲于2018年。批次A產(chǎn)自新疆維吾爾自治區(qū)焉耆縣；批次B產(chǎn)自新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)；批次C產(chǎn)自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市；批次D產(chǎn)自甘肅省會寧縣。種子樣品扦取參考InternationalRulesforSeedTesting第2章扦樣，在隨機(jī)選取的不同種子袋中抽取等量初次樣品，混合后為送檢樣品[7]。

1.2 方法

1.2.1種子外部帶菌檢測 隨機(jī)選取4個批次甘草種子各10 g(1000粒)分別放入均質(zhì)袋內(nèi)，加入無菌水20 mL拍打60 s，吸取全部懸浮液，12 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為16 cm)，除去上清液，加入1 mL無菌水均勻懸浮沉淀，取適量懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4，每個稀釋梯度菌懸液吸取100 μL均勻涂布到aPDA培養(yǎng)基上，每個濃度重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察記錄平板上的菌落總數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和檢測種子數(shù)計算種子外部攜帶的孢子負(fù)荷量和檢出真菌的分離比例。每個供試種子批次重復(fù)4次。

孢子負(fù)荷量=3皿菌落總數(shù)/0.3 mL×稀釋倍數(shù)/1000

(1)

分離比例=(某類真菌菌落個數(shù)/菌落總數(shù))×100%

(2)

1.2.2種子內(nèi)部帶菌檢測 4個批次甘草種子樣品隨機(jī)選取100粒種子作為1個重復(fù)，用75%乙醇浸泡30 s，1%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，然后用無菌水沖洗3次，晾干，將種子均勻擺放在aPDA平板上，每個平板上擺放20粒，共5皿，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄平板上的菌落總數(shù)并拍照，每個供試品種批次設(shè)置4個重復(fù)。

隨機(jī)選取4個批次甘草各100粒，用98%硫酸浸泡50 min，然后用無菌水沖洗3次，晾干。將種子均勻擺放在aPDA平板上，每個平板上擺20粒，共5皿，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄平板上的菌落總數(shù)并拍照，每個供試品種樣品重復(fù)4次。根據(jù)公式(3)～(4)計算種子帶菌率和分離頻率。

種子帶菌率=(帶菌種子數(shù)/檢測種子總數(shù))×100%

(3)

分離頻率=(帶某類菌種子數(shù)/帶菌種子數(shù))×100%

(4)

1.2.3真菌形態(tài)學(xué)鑒定 將分離到的不同種類的真菌轉(zhuǎn)移到aPDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，然后通過顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)，結(jié)合真菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征，參考相關(guān)工具書和文獻(xiàn)鑒定到屬[8-10]。

1.2.4真菌分子鑒定 收集在aPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d的真菌菌絲至1.5 mL離心管中，分別編號，放入液氮中充分冷卻后取出研磨充分。采用核酸快速提取試劑盒，按照操作使用說明提取DNA，提取的DNA質(zhì)量濃度稀釋到50 ng·μL-1，保存在-20 ℃。

以上述提取總DNA為模板，用真菌通用引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。擴(kuò)增體系為2×mix 2 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，ddH2O 19 μL，檢測樣品 2 μL。PCR擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，終止溫度在4 ℃。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物測序，通過BLAST序列比對，鑒定到屬、種。

1.2.5甘草種子芽率與幼苗發(fā)病率測定 將甘草種子浸泡于98%硫酸 25 ℃處理50 min，至種皮表面破損出現(xiàn)均勻小點，在超凈工作臺上用無菌水洗凈晾干，取100粒播種于滅菌的基質(zhì)中，設(shè)置4次重復(fù)，于7、14 d記錄種子發(fā)芽率，同時觀察并記錄幼苗發(fā)病情況。

1.2.6真菌致病性測定 將甘草幼苗每盆移植2株，放入光照(20 ℃，16 h光照，8 h黑暗)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在幼苗生長12 d時進(jìn)行實驗。將純化的6個真菌菌株(曲霉、鏈格孢、毛霉、尖孢鐮刀菌、芽枝狀枝孢霉、立枯絲核菌)在aPDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4～5 d，形成一定大小的菌落。用滅菌的打孔器在菌落靠近邊緣處打取菌餅(Φ=6 mm)，將菌餅貼附于甘草幼苗莖基部，每個菌株處理3株幼苗作為重復(fù)。對照組采用無菌的aPDA瓊脂塊(Φ=6 mm)貼附于甘草幼苗莖基部。接種完畢后將甘草幼苗放在光照培養(yǎng)箱中(25 ℃，16 h/8 h、光照/黑暗)繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其發(fā)病情況。將上述處理后甘草幼苗的發(fā)病部位用75%酒精消毒，切取片段放入aPDA平板中培養(yǎng)，分離純化后按照1.2.3、1.2.4項下進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子學(xué)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 種傳真菌鑒定

2.1.1種傳真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 如圖1所示，根據(jù)真菌的形態(tài)和在顯微鏡下菌絲與孢子的形態(tài)初步確定分離得到部分菌株為鏈格孢屬Alternariaspp.、青霉屬Penicilliumspp.和曲霉屬Aspergillusspp.真菌。

注：A.鏈格孢屬Alternaria sp.菌落形態(tài)；B.青霉屬Penicillium sp.菌落形態(tài)；C.曲霉屬Aspergillus sp.菌落形態(tài)；D.鏈格孢屬Alternaria sp.在顯微鏡下(10×20倍)分生孢子與菌絲形態(tài)；E.青霉屬Penicillium sp.在顯微鏡下(10×10倍)分生孢子與菌絲形態(tài)；F.曲霉屬Aspergillus sp.在顯微鏡下(10×10倍)分生孢子與孢子梗形態(tài)。圖1 分離真菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

2.1.2種傳真菌分子鑒定結(jié)果 未能通過形態(tài)鑒定的菌株通過ITS測序在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)比對序列鑒定菌株有曲霉Aspergillussp.、互隔交鏈孢霉Alternariaalternata、毛霉Mucorsp.、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、芽枝狀枝孢霉Cladosporioides；種子內(nèi)部攜帶尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum及互隔交鏈孢霉Alternariaalternata(見表1)。

表1 分離菌株ITS序列比對結(jié)果

2.2 甘草種子外部攜帶真菌種類

甘草種子外部帶菌檢測結(jié)果如表2所示，不同批次的甘草種子外部帶菌量差異較大，在所檢測的4批次中，批次A的外部帶菌量最高，每粒種子的平均孢子負(fù)荷量為7.1個，且與其他批次差異顯著。甘草種子外部主要攜帶的真菌有青霉屬Penicilliumspp.、曲霉屬Aspergillusspp.、鏈格孢屬Alternariaspp.、芽枝狀枝孢霉Cladosporiumcladosporioides、毛霉屬Mucorspp.、立枯絲核菌R.solani等。其中，致病菌有立枯絲核菌R.solani和曲霉Aspergillus。

表2 甘草種子外部帶菌檢測結(jié)果

2.3 甘草種子內(nèi)部攜帶真菌種類

甘草種子內(nèi)部攜帶真菌檢測結(jié)果如表3所示，不同批次的甘草種子內(nèi)部帶菌率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。批次A的內(nèi)部帶菌率最高，為25%，與批次B和C差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與批次D差異無統(tǒng)計學(xué)意義，甘草種子內(nèi)部攜帶的真菌主要有青霉屬Penicilliumspp.、曲霉屬Aspergillusspp.、鏈格孢屬Alternariaspp.和尖孢鐮刀菌F.oxysporum。4個批次甘草種子均攜帶鏈格孢屬Alternariaspp.，批次A和C帶有青霉屬Penicilliumspp.，批次D有曲霉屬Aspergillusspp.。在批次A中還發(fā)現(xiàn)了尖孢鐮刀菌F.oxysporum，其中致病菌有尖孢鐮刀菌F.oxysporum和曲霉Aspergillus。

表3 甘草種子內(nèi)部帶菌檢測結(jié)果 %

2.4 甘草種子外部帶菌量與內(nèi)部帶菌率的相關(guān)性分析

甘草種子外部帶菌量與內(nèi)部帶菌率相關(guān)性分析結(jié)果如圖2所示，甘草種子外部帶菌量與內(nèi)部帶菌率呈正相關(guān)關(guān)系，甘草種子外部帶菌量越高，種子內(nèi)部帶菌率就越高；種子外部帶菌量每升高1個/粒，種子內(nèi)部帶菌率就增加2.965%。此外，3個批次的種子外部、內(nèi)部均分離得到鏈格孢屬，分析發(fā)現(xiàn)種子外部鏈格孢屬量和內(nèi)部鏈格孢屬帶菌率具有類似相關(guān)性(見圖3)，表明可通過種子外部帶菌量可以推測種子內(nèi)部帶菌率情況。

圖2 甘草種子外部帶菌量與內(nèi)部帶菌率的相關(guān)性

圖3 甘草種子外部與內(nèi)部攜帶鏈格孢量的相關(guān)性

2.5 未處理和98%硫酸處理過的甘草種子發(fā)芽率比較結(jié)果

未處理和用98%硫酸處理過的甘草種子發(fā)芽率(見圖4)。用98%硫酸處理過的比未處理的甘草種子發(fā)芽率高，說明98%硫酸可以幫助打破甘草的種皮機(jī)械障礙促進(jìn)種子發(fā)芽。用98%硫酸處理的甘草種子批次A、B、C、D的發(fā)芽率分別為100%、88%、74%、54%；不做處理的甘草種子批次A、B、C、D的發(fā)芽率分別為46%、10%、12%、12%。經(jīng)差異性分析得出4個批次的甘草種子經(jīng)98%硫酸處理后的發(fā)芽率均顯著高于未處理種子。

圖4 未處理和98%硫酸處理過的甘草種子發(fā)芽率(n=400)

2.6 98%硫酸處理對甘草種子幼苗發(fā)病率的影響

未處理和用98%硫酸處理過的甘草種子幼苗發(fā)病率不同(見圖5)，未處理的甘草種子幼苗發(fā)病率較高，其幼苗發(fā)病率分別為61%、11%、33%、40%；用98%硫酸處理大大降低了甘草種子幼苗的發(fā)病率，可以殺死其表面的部分真菌，其幼苗發(fā)病率分別是4%、0%、2.7%、7.1%。

圖5 未處理和98%硫酸處理過的甘草幼苗發(fā)病率(n=400)

2.7 真菌致病性檢測

將純化的真菌菌株(曲霉、鏈格孢、毛霉、尖孢鐮刀菌、芽枝狀枝孢霉、立枯絲核菌)回接到健壯甘草幼苗莖基部上，9 d后發(fā)現(xiàn)回接尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌的甘草幼苗發(fā)生枯萎癥狀(見圖6)，將發(fā)病幼苗病變部位用75%乙醇消毒后放在aPDA平板上，2 d后發(fā)現(xiàn)接種立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌的培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與所接種真菌的菌落形態(tài)一致。通過16 S ITS序列比對，確認(rèn)分離菌株為接種菌株。通過接種試驗確認(rèn)了種傳尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌可引起甘草幼苗病害。

注：A.無菌aPDA接種的對照植株；B.立枯絲核菌 Rhizoctonia solani接種植株；C.尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum接種植株；D.立枯絲核菌 Rhizoctonia solani菌落形態(tài)；E.尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum菌落形態(tài)。圖6 甘草種子真菌致病性結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究對4個不同批次的甘草種子進(jìn)行內(nèi)外部攜帶真菌檢測。結(jié)果表明，不同批次的種子帶菌量與真菌種類均有差異。雖然4個批次甘草種子經(jīng)過了相同的加工與存儲過程，但是由于產(chǎn)自不同地區(qū)，種子的帶菌情況受到發(fā)育過程不同環(huán)境影響而不同。據(jù)相關(guān)報道，甘草種子攜帶的真菌主要有曲霉菌、青霉菌、根霉菌和鏈格孢菌[11]。本研究發(fā)現(xiàn)甘草種子攜帶的真菌還包括芽枝狀枝孢霉、毛霉屬、立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌。甘草種子攜帶的真菌中鏈格孢菌所占的比例最高，同時進(jìn)行了真菌致病性測定，經(jīng)過接種幼苗后再分離發(fā)病植物組織，得到尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌為致病菌。為進(jìn)一步確認(rèn)甘草種子可攜帶的致病真菌，下一步研究可開展相同產(chǎn)區(qū)不同種子批次，不同年份收獲種子批次帶菌檢測分析。

一般情況下，種子內(nèi)部帶菌檢測采用次氯酸鈉消毒，而后將種子擺放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)[12]。本研究由于使用次氯酸鈉消毒后種子培養(yǎng)時有大量細(xì)菌生長，干擾檢測，因此采用了98%硫酸處理后的種子進(jìn)行內(nèi)部帶菌檢測，消除了細(xì)菌的干擾，其攜帶的真菌并沒有被完全消滅，說明98%硫酸未能將甘草種子內(nèi)部攜帶的真菌完全清除，在適宜的條件下也可用于種子外部消毒。

測定98%硫酸處理和未處理甘草種子的幼苗發(fā)芽率與發(fā)病率時發(fā)現(xiàn)，98%硫酸處理過的甘草幼苗發(fā)芽率顯著升高且發(fā)病率顯著降低，說明98%硫酸處理可以促進(jìn)種子萌發(fā)并殺死甘草種子表面攜帶的部分真菌，降低甘草幼苗發(fā)病率。尤其是批次A的甘草種子用98%硫酸處理后發(fā)芽率達(dá)到100%，98%硫酸處理可使甘草種子種皮破損利于發(fā)芽[13]，發(fā)病率也顯著降低，可以作為推薦甘草種子處理方式。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，甘草種子外部帶菌量和內(nèi)部帶菌率存在正相關(guān)關(guān)系，可以通過甘草種子外部帶菌量推測甘草種子內(nèi)部帶菌率。研究結(jié)果可以為甘草種子藥劑處理預(yù)防種傳病害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。