ICP-MS分析不同產(chǎn)地鐵皮石斛中24種無機(jī)元素△

趙玉洋，呂朝耕，何雅莉，郝校鵬，周利，楊健*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450008

鐵皮石斛藥材為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖[1]，食用及藥用歷史悠久，具有益胃生津、滋陰清熱作用，在民間被稱為“救命仙草”，《道藏》中尊其為“中華九大仙草”之首[2]?，F(xiàn)代研究表明，其主要成分包括多糖、黃酮、有機(jī)酸、石斛酚及多種無機(jī)元素[3-5]，具有增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗氧化、降血糖、降血壓、抗肝損傷、抗腫瘤等作用[6-7]。隨著人工栽培鐵皮石斛技術(shù)的成熟推廣，目前安徽、浙江、云南、廣東、廣西、福建等地均已實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛的規(guī)模生產(chǎn)，但不同產(chǎn)地鐵皮石斛在產(chǎn)品質(zhì)量及市場價格等方面均存在較大差異。隨著道地性保護(hù)、地理標(biāo)識和原產(chǎn)地保護(hù)制度的建立和完善，鐵皮石斛產(chǎn)地溯源的需求日益凸顯，而植物樣本中無機(jī)元素含量可以在一定程度上反映出其生境地理環(huán)境的信息[8]。因此，開展鐵皮石斛中無機(jī)元素的檢測及其與樣品產(chǎn)地的相關(guān)性分析研究具有積極的意義。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)法因其具有高靈敏度和準(zhǔn)確性而被廣泛應(yīng)用于食品、中藥、水土環(huán)境等樣本中痕量元素的含量檢測[9-12]。本研究采用微波消解-ICP-MS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對我國6個省11個不同產(chǎn)地的鐵皮石斛無機(jī)元素進(jìn)行檢測分析，以期為鐵皮石斛藥材的質(zhì)量控制及產(chǎn)地溯源相關(guān)的地理標(biāo)志保護(hù)等提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

11個不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品于2015年10月—2016年11月采集(見表1)，每個產(chǎn)地7個批次。樣品經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷副研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖。經(jīng)MM400型混合球磨儀粉碎后過60目篩，干燥條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 鐵皮石斛采樣地和樣品信息

1.2 儀器與試劑

ICAP-Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher科技公司)；MARS6型微波消解儀(美國CEM公司)；AUW120D型電子天平(日本島津公司)；MM400型混合球磨儀(德國Retsch公司)；DST-1000型酸純化器(美國Savillex公司)；Mill-Q型超純水機(jī)(德國Millipore公司)；混合對照品溶液Muti-element Solution 1和Muti-element Solution 2(美國SPEX Certi Perp公司，批號：XPNCN-17-100)；內(nèi)標(biāo)溶液為10 μg·mL-1的Rh溶液稀釋1000倍(鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司，批號：NCS141058-2017)；由酸純化器二次純化的分析級硝酸(德國Merck公司)；分析級過氧化氫溶液(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS條件

射頻功率為15 500 W，采樣深度為5.0 mm；輔助氣和載氣均為氬氣，流速分別為0.8、1.05 L·min-1；冷氣流流速為14.0 L·min-1；霧化器類型為同心霧化器；霧化室溫度為2 ℃；掃描方式為STD模式；采集點(diǎn)和重復(fù)次數(shù)均為3次。

2.2 溶液制備

2.2.1混合對照品溶液制備 精密量取各混合對照品溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋，制成各元素質(zhì)量濃度均為10 μg·mL-1的混合對照品儲備液，4 ℃貯存?zhèn)溆?，后續(xù)進(jìn)一步稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備 精確稱取鐵皮石斛藥材粉末0.1 g，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，分別加入過氧化氫溶液1 mL和硝酸5 mL，密閉消解罐，置于微波消解儀中消解，消解程序：6 min升溫至100 ℃ 保持3 min；7 min升溫至160 ℃ 保持4 min；6 min升溫至190 ℃ 保持30 min。消解完全后，待樣品稍冷卻，將消解內(nèi)罐置電熱板上180 ℃趕酸至剩余1 mL，自然冷卻，用超純水定容至10 mL，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得待測供試品溶液。分別精密量取上述供試品溶液1 mL至10 mL(K、Ca、Mg)或100 mL(Na)量瓶中，以超純水定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得Na元素和K、Ca、Mg元素供試品溶液。按相同方法制備空白對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照品儲備液適量，加2%硝酸溶液稀釋，分別配成K、Ca、Na、Mg質(zhì)量濃度為20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1的溶液；Zn、Mn、Rb、Fe質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100、200、500 ng·mL-1溶液；Li、V、Cr、Co、Ni、Cu、Ga、As、Sr、Cd、Cs、Ba、La、Nd、Tl、Pb質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 ng·mL-1系列混合對照品溶液。按2.1項下條件進(jìn)樣檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計數(shù)比率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)。將混合對照品溶液逐步稀釋，直至各元素信號值為空白溶液信號值的3倍和10倍左右，此時各元素的質(zhì)量濃度即分別為該元素的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。

表2 24種無機(jī)元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.3.2精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液，按照2.1項下條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各元素響應(yīng)信號值RSD。結(jié)果顯示，各元素響應(yīng)信號值RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性考察 取同一份鐵皮石斛供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h按2.1項下條件進(jìn)樣測定，記錄各元素響應(yīng)信號值，計算不同時間點(diǎn)間各元素計數(shù)比率值的RSD。結(jié)果各元素RSD值均小于3.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)能穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性考察 取同一鐵皮石斛樣品0.1 g，平行操作6份，測定并計算各元素含量。結(jié)果顯示，6份樣品中各元素含量的RSD在1.69%～8.85%，重復(fù)性良好，可以滿足檢測要求。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn) 取已知各元素含量的鐵皮石斛樣品0.1 g，加入各元素對照品儲備液適量，平行操作3份，采用與鐵皮石斛樣品相同的操作步驟和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測定并記錄各元素響應(yīng)信號值。結(jié)果顯示，各元素的平均加樣回收率為85.5%～122.3%，RSD均小于12%，表明在痕量分析的要求下，各元素回收率良好，表明該方法有效可行。

2.4 鐵皮石斛樣品檢測

精密稱取77批不同來源的鐵皮石斛樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下條件進(jìn)行含量測定。結(jié)果見表3。

表3結(jié)果表明，在測定的24種無機(jī)元素中，K元素平均含量最高，各產(chǎn)地樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在6000 mg·kg-1以上，最高達(dá)到15 724.80 mg·kg-1；各產(chǎn)地樣品中Ca和Mg元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5000、1000 mg·kg-1以上；除浙江天臺樣品中Na元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1 386.40 mg·kg-1外，各產(chǎn)地樣品中Na元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200～400 mg·kg-1。此外，各鐵皮石斛樣品中Li、V、Cr、Co、Ni、Ga、As、Cd、La和Pb 10種無機(jī)元素的含量較低，均小于0.1 mg·kg-1。

表3 不同產(chǎn)地鐵皮石斛中24種元素的含量(n=7) mg·kg-1

就不同產(chǎn)地樣品間比較，Na、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba 6種元素在不同樣品間含量變異系數(shù)較大，達(dá)到69.7%以上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Na元素含量差異主要由浙江天臺樣品遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地樣品引起；Mn含量差異主要來源于廣西容縣和貴州施秉樣品，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到40.85、20.85 mg·kg-1，至少高出其他產(chǎn)區(qū)樣品含量一倍以上。Cu、Zn、Sr、Ba4種元素則表現(xiàn)出相對一致的規(guī)律，浙江5個產(chǎn)地樣品中的含量普遍低于除云南樣品外的其他各產(chǎn)地樣品，其中浙江樣品中Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為3～8 mg·kg-1，其他產(chǎn)區(qū)樣品達(dá)到35～80 mg·kg-1，相差達(dá)10倍以上；浙江樣品Cu元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.87～2.07 mg·kg-1，其他產(chǎn)地為2.48～15.79 mg·kg-1；浙江樣品Sr和Ba質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.82～1.44、0.55～1.16 mg·kg-1，其他產(chǎn)地樣品為1.92～6.12、1.13～4.66 mg·kg-1。此外，Li、Cr、Fe、Ga、As、Cd、Tl 7種元素含量變異系數(shù)均在15%以下，表明鐵皮石斛中這些元素含量較為穩(wěn)定，與產(chǎn)地環(huán)境變化相關(guān)性較低。就總元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)看，安徽霍山樣品最高，達(dá)26 060.10 mg·kg-1；其次是浙江天臺平橋鎮(zhèn)樣品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24 480.50 mg·kg-1，廣西容縣樣品的元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也大于20 000 mg·kg-1；其他產(chǎn)地樣品間差異較小，約為15 000 mg·kg-1左右。總體就元素含量分析來看，不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品間表現(xiàn)出了一定差異，特別是Cu、Zn、Sr、Ba 4種元素可能作為區(qū)分浙江產(chǎn)鐵皮石斛與除云南外的其他產(chǎn)地樣品的指標(biāo)?；诖?，后續(xù)研究進(jìn)一步采用多元統(tǒng)計分析方法嘗試進(jìn)行不同產(chǎn)地鐵皮石斛鑒別。

2.5 基于元素分析的不同產(chǎn)地鐵皮石斛主成分分析(PCA)

基于鐵皮石斛樣品中24種無機(jī)元素含量，對6個省份11個產(chǎn)地鐵皮石斛進(jìn)行PCA，見圖1。結(jié)果表明，各產(chǎn)地樣品總體可實(shí)現(xiàn)分別聚類，其中浙江省內(nèi)各產(chǎn)地樣品可聚為一類，但與云南廣南樣本存在重疊；雖然同屬廣西省，但容縣和西林產(chǎn)鐵皮石斛樣本間距離較遠(yuǎn)。但浙江省內(nèi)武義、樂清、天臺3地間距離均在200 km左右，而容縣和西林距離達(dá)到約700 km，這種地理距離的巨大差異可能是導(dǎo)致容縣與西林樣品間存在較大差異的原因。浙江樣品與云南樣品的重疊，表明云南與浙江產(chǎn)鐵皮石斛間確實(shí)存在一定相似性。作為鐵皮石斛的兩大規(guī)模產(chǎn)區(qū)，市場上云南產(chǎn)鐵皮石斛與浙江產(chǎn)鐵皮石斛價格相差可以達(dá)到數(shù)十倍以上，因此常有以云南產(chǎn)鐵皮石斛冒充浙江產(chǎn)鐵皮石斛的情況。此外，浙江省內(nèi)樣品間，浙江武義的2批樣品和浙江樂清的2批樣本分別可以實(shí)現(xiàn)聚類，種表明元素分析在大產(chǎn)地總體鑒別基礎(chǔ)上，對浙江省內(nèi)不同產(chǎn)地樣品間同樣具有一定鑒別能力。載荷圖(見圖1B)結(jié)果顯示，24種無機(jī)元素對石斛樣品產(chǎn)地區(qū)分的貢獻(xiàn)情況，其中距離坐標(biāo)軸中心越遠(yuǎn)的元素對分類結(jié)果的貢獻(xiàn)率越大，Ni、La、Ba、Zn、Sr、Mn、Ca、Mg、Cs、Cu、Nd、Rb 12種元素可能為不同產(chǎn)地鐵皮石斛聚類分布的特征貢獻(xiàn)因子。

注：A.PCA得分圖；B.載荷圖。圖1 鐵皮石斛樣品中24種無機(jī)元素的PCA得分圖和載荷圖

2.6 基于元素分析的不同產(chǎn)地鐵皮石斛聚類分析

基于明氏距離(Minkowski distance)進(jìn)行相似性度量，分別以全部24種無機(jī)元素和PCA中得到的12種主要特征貢獻(xiàn)因子元素，對6個省份11個產(chǎn)地鐵皮石斛樣品進(jìn)行聚類分析，見圖2。

由圖2A可知，以全部24種無機(jī)元素未能實(shí)現(xiàn)較好的聚類，浙江省內(nèi)各產(chǎn)地樣品未能聚為一類，且與廣西和貴州樣品距離相近，特別是浙江樂清大荊鎮(zhèn)樣品與其他樣品距離較遠(yuǎn)。由圖2B可知，基于12種主要特征貢獻(xiàn)因子元素的聚類分析，在類間距離等于2.5時，即實(shí)現(xiàn)了浙江省5個小產(chǎn)區(qū)(浙江樂清大荊鎮(zhèn)、浙江樂清雁蕩鎮(zhèn)、浙江武義泉溪鎮(zhèn)、浙江武義白姆鄉(xiāng)和浙江天臺平橋鎮(zhèn))鐵皮石斛樣品的準(zhǔn)確聚類。在更大類間距離上可以看到廣東和云南樣品與其他產(chǎn)地樣品差異較大，特別是與PCA結(jié)果相比，云南樣品與浙江樣品實(shí)現(xiàn)了區(qū)分。上述結(jié)果表明，無機(jī)元素含量測定結(jié)合多元統(tǒng)計分析對不同產(chǎn)地來源的鐵皮石斛樣品表現(xiàn)出一定的溯源潛力，特別是能夠?qū)φ憬a(chǎn)鐵皮石斛進(jìn)行有效的判定。

注：A.基于24種元素含量的聚類分析；B.基于12種主要特征貢獻(xiàn)因子元素的聚類分析。圖2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品聚類分析譜系圖

3 結(jié)語

本研究建立了利用微波消解-ICP-MS技術(shù)的鐵皮石斛中24種無機(jī)元素含量測定方法，所建立方法準(zhǔn)確、可靠。進(jìn)一步應(yīng)用所建立方法對不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品進(jìn)行測定，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法嘗試進(jìn)行不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品的產(chǎn)地溯源鑒別。PCA結(jié)果顯示，除浙江和云南樣品存在重疊外，各產(chǎn)地樣品可分別聚類，同時Ni、La、Ba、Zn、Sr、Mn、Ca、Mg、Cs、Cu、Nd和Rb 12種元素表現(xiàn)為不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品聚類的主要特征貢獻(xiàn)因子，進(jìn)一步利用上述12種元素進(jìn)行基于明氏距離的聚類分析，結(jié)果表明，無機(jī)元素含量測定結(jié)合多元統(tǒng)計分析對不同產(chǎn)地來源的鐵皮石斛樣品表現(xiàn)出一定的溯源潛力，特別是能夠?qū)φ憬a(chǎn)鐵皮石斛進(jìn)行有效判定。本研究可為鐵皮石斛藥材的質(zhì)量控制及產(chǎn)地溯源相關(guān)的地理標(biāo)志保護(hù)等提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。