消癌解毒方黃酮類成分及其給藥后在大鼠體內分布△

錢桂英，閆秋瑩，蔣家璐，范匯森，譚佳妮，程海波，孫東東*

1.南京中醫(yī)藥大學 常熟附屬醫(yī)院，江蘇 蘇州 215500；2.國家中醫(yī)藥管理局 名醫(yī)驗方評價與轉化重點研究室/江蘇省抗腫瘤驗方研究與產業(yè)化工程實驗室/江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心/南京中醫(yī)藥大學 轉化醫(yī)學研究中心，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023

消癌解毒方是在傳承發(fā)展國醫(yī)大師周仲瑛“癌毒”學術思想基礎上，基于癌毒病機理論，針對癌毒病機演變規(guī)律形成的抗腫瘤臨床有效系列驗方。全方攻補兼施，結合不同惡性腫瘤的主要病理因素及具體癌毒的類型，其組成各有區(qū)別，臨證可根據(jù)不同病位相應選擇不同的方藥，以取得更好的療效[1-3]。本實驗所用方劑由半枝蓮、預知子、山慈菇、莪術、太子參和麥冬組成，臨床上主要用于胃癌治療。方中半枝蓮為君藥，具有清熱解毒、消腫散結的功效，在臨床治療中與其他藥聯(lián)合使用，發(fā)揮增效減毒作用[4]。

據(jù)文獻報道，天然黃酮類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性[5]，是抗癌方劑中的重要活性成分。而本方中半枝蓮、麥冬等也含有多種黃酮類成分，這些成分在消癌解毒方配伍煎煮前后是否發(fā)生變化，是否到達機體器官以及如何在體內發(fā)生吸收、分布、轉移等尚不十分明確，闡釋這些問題對于揭示復方的物質基礎和作用機制具有重要意義。本實驗建立超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF-MS)檢測消癌解毒方水提液中黃酮類成分的方法，同時研究大鼠灌胃給予消癌解毒方水提液后黃酮類成分在體內的分布情況，為進一步闡釋消癌解毒方中特征化學成分及其在體內的變化分布規(guī)律提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±20) g，購于南通大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2014-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0031。

1.2 試藥

半枝蓮(批號：170501，產地：湖北)、預知子(批號：170505，產地：河北)、山慈菇(批號：170105，產地：貴州)、莪術(批號：170310，產地：廣西)、太子參(批號：170425，產地：河北)、麥冬(批號：170115，產地：四川)均購于湖北聚瑞中藥飲片有限公司，經南京中醫(yī)藥大學陳建偉教授鑒定分別為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草、木通科植物木通Akebiaquinata(Thunb.) Decne.的干燥近成熟果實、蘭科植物杜鵑蘭Gremastraappendiculata(D.Don) Makino的干燥假鱗莖、姜科植物蓬莪術CurcumaphaeocaulisVal.的干燥根莖、石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根及百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根；甲醇、乙腈均為質譜純，購自美國默克公司；甲酸為質譜純，購自CNW公司。

1.3 儀器

CPA225D型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；SPE固相萃取小柱(德國CNW公司)；LC-30A型超高效液相色譜系統(tǒng)，配有LC-30AD型二元液相泵、SIL-30AC型自動進樣裝置、DGU-20A5R型在線脫氣裝置、CTO-30A型柱溫箱(日本Shimadzu公司)；Triple TOF 5600型高分辨質譜系統(tǒng)，包含電噴霧離子源(ESI)、Analyst TF 1.6及Peak View等質譜分析軟件(美國AB Sciex公司)；KH-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；CentriVap型離心濃縮儀(美國Labconc公司)；超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 水煎液供試品制備

按消癌解毒方組方配比，稱取半枝蓮5 g、預知子2.25 g、山慈菇2.25 g、莪術2.25 g、太子參3.75 g、麥冬2.5 g，合并后依次加入10、8倍量水，煎煮2、1.5 h，合并2次濾液并濃縮至質量濃度為1 g·mL-1(以生藥量計)供化學成分分析使用，濃縮至質量濃度為2.88 g·mL-1(以生藥量計)供大鼠灌胃給藥使用。

量取1 mL濃縮液加入SPE固相萃取小柱，分別采用體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%、100%的乙腈水溶液作為流動相進行洗脫，完整收集不同濃度下的濾液，渦旋混勻，12 000 r·min-1離心5 min(離心半徑7 cm)，離心2次，取上清液即得供試品溶液。

2.2 動物分組與給藥

12只雄性SD大鼠，適應性飼養(yǎng)1周，自由飲食，室溫18～26 ℃，濕度40%～60%，正常晝夜交替。將大鼠隨機分為2組，分別為對照組和給藥組，每組6只，分別飼養(yǎng)于代謝籠中，實驗前12 h禁食，自由飲水。根據(jù)臨床人用劑量進行換算后，給藥組大鼠灌胃給予2.1項下制備的消癌解毒方水提液15.12 g·kg-1，對照組大鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d。

2.3 樣品采集與處理

2.3.1尿液、糞便、血漿樣品的收集與處理 第1次和第2次給藥后，分別收集給藥組和對照組大鼠0～24 h尿液和糞便樣本。尿液樣本使用離心濃縮儀進行濃縮干燥，糞便樣本使用恒溫干燥箱40 ℃進行干燥。兩者分別加入適量甲醇，超聲提取30 min，尿液和糞便樣品分別進行2次、3次離心，5000 r·min-1離心15 min(離心半徑7 cm)，取上清，離心濃縮干燥。末次給藥后，分別于0.5、1.0、1.5 h眼眶取血，血液樣本5000 r·min-1、4 ℃離心10 min(離心半徑7 cm)，獲得血漿樣本。取適量血漿樣本中加入4倍量體積甲醇，超聲提取30 min，提取物5000 r·min-1離心15 min(離心半徑7 cm)，取上清，離心，濃縮干燥。

樣品均用甲醇復溶，13 000 r·min-1離心10 min(離心半徑7 cm)，離心2次，取上清進樣。

2.3.2組織樣品的收集與處理 在收集完血液樣本之后，使用心臟灌注器快速清除組織中的血液，收集心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸。稱取適量組織樣本，加入4倍量預冷0.9%氯化鈉溶液進行勻漿。每種組織樣本取6 mL勻漿液，加入8倍量甲醇，超聲提取30 min，5000 r·min-1、4 ℃離心10 min(離心半徑7 cm)，取上清，離心濃縮干燥。取干燥組織樣本復溶于1 mL甲醇，13 000 r·min-1離心10 min(離心半徑7 cm)，離心2次，取上清進樣檢測。

2.4 檢測條件

2.4.1水煎液檢測色譜條件 Agilent C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)反相色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.01 min，5%B；0.01～0.5 min，5%～10%B；0.5～20 min，10%～32%B；20～25 min，32%～70%B；25～27 min，70%～100%B；27～28 min，100%B；28～30 min，100%～5%B；30～31 min，5%B)。柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1，進樣量5 μL。

2.4.2生物樣品檢測色譜條件 Agilent C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)反相色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.01 min，5%B；0.01～2 min，5%～50%B；2～8 min，50%～54%B；8～10 min，54%～90%B；10～13 min，90%～100%B；13～14 min，100%B；14～17 min，100%～5%B；17～18 min，5%B)。柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1，進樣量5 μL。

2.4.3質譜條件 采用ESI，正、負離子模式下采集數(shù)據(jù)；多反應監(jiān)測模式(MRM)；離子噴霧電壓(ISVF)為4 500.00 V(正離子模式)/-4 500.00 V(負離子模式)；去簇電壓(DP)為60.00 V(正離子模式)/-60.00 V(負離子模式)；霧化氣(GS1)壓力為378.95 kPa；輔助氣(GS2)壓力為378.95 kPa；氣簾氣(CUR)壓力為378.95 kPa；去溶劑溫度(TEM)550.00 ℃；碰撞能量擴展(CES)為10.00 eV。

2.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)文獻和數(shù)據(jù)庫搜集半枝蓮中黃酮類成分，從Chemical book尋找目標化合物結構，利用Peak view質譜分析軟件尋找目標化合物，參考文獻并根據(jù)二級碎片和結構的匹配度進行確證。

3 結果

3.1 化學成分分析

消癌解毒方水提液樣品在正、負離子模式下的基峰總離子流圖(見圖1)顯示，多種化合物被檢測出，并且分離狀況良好。綜合保留時間(tR)、質譜特征碎片和裂解途徑等信息，共鑒定出23個黃酮類化合物，其中正黃酮類化合物13個(峰3～5、7、8、10～12、15～19)、二氫黃酮類化合物5個(峰2、6、9、13、14)、黃酮醇類化合物1個(峰1)、高異黃酮類化合物4個(峰20～23)，具體信息見表1。

圖1 消癌解毒方水提液正、負離子模式下總離子流圖

表1 LC-MS/MS正、負離子模式下消癌解毒方水煎液中化學成分鑒定

續(xù)表1

黃酮類化合物主要是指由2苯環(huán)(A環(huán)與B環(huán))通過中間三碳鏈連接而成的化合物，黃酮的質譜裂解特征主要是C環(huán)斷裂，得到含有完整A環(huán)和B環(huán)的離子碎片，裂解方式見圖2。高異黃酮與其他黃酮結構稍有不同，高異黃酮C環(huán)與B環(huán)連接處多1個亞甲基，該結構會使其在質譜條件下亞甲基處首先發(fā)生斷裂，隨后A環(huán)發(fā)生斷裂。黃酮苷類化合物糖苷鍵較易先斷裂，之后再發(fā)生黃酮母核的斷裂。此外，黃酮類化合物的取代基多為羥基、甲基、甲氧基，其中甲氧基較易斷裂，結合黃酮類化合物的斷裂規(guī)律，可以推斷出各環(huán)上取代基情況。選取23個黃酮成分中的部分代表性結構進行解析。

圖2 黃酮裂解方式

化合物1(tR=5.56 min)在負離子模式下，根據(jù)母離子m/z609.143 6[M-H]-，得到化學式為C27H30O16。在MS2中，特征碎片離子為m/z447.091 0[M-H-C6H11O5]-、m/z285.039 5[M-H-C6H11O5-C6H10O5]-，由此推斷其結構中含有1分子鼠李糖，1分子葡萄糖，結合文獻推測化合物1為黃酮醇苷類成分蘆丁[6]。

化合物14(tR=18.5 min)在負離子模式下，根據(jù)母離子m/z271.061 5[M-H]-，得到化合物化學式為C15H12O5。在MS2中，特征碎片離子為m/z151.003 8(1，3A-)、m/z119.051 2(1，3B-)，表明A環(huán)上存在2個羥基，B環(huán)上存在1個羥基，結合文獻推測化合物14為二氫黃酮成分柚皮素[9]。

化合物20(tR=24.18 min)在負離子模式下，根據(jù)母離子m/z359.113 0[M-H]-，得到化合物化學式為C19H20O7。在MS2中，特征碎片離子m/z344.088 6[M-H-CH3]-、m/z329.064 6[M-H-OCH3]-、m/z223.058 5[M-H-(B ring+CH)]-、m/z208.037 0[M-H-(B ring+CH)-CH3]-和m/z169.049 6，表明1，3A-失去1個CO，結合前面的碎片提示A環(huán)有1個甲氧基、1個甲基、2個羥基，結合文獻推測化合物20為高異黃酮成分麥冬黃烷酮E[11]。

化合物22(tR=25.76 min)在正離子模式下，根據(jù)母離子m/z343.117 2[M+H]+，得到化合物化學式為C19H18O6，在MS2中，特征碎片離子為m/z207.065 9、m/z135.044 3，推斷高異黃酮C3-C9鍵斷裂，結合文獻推測化合物22為高異黃酮成分甲基麥冬黃烷酮A[11]。

化合物1、14、20、22的二級質譜見圖3。

圖3 消癌解毒方黃酮類化合物1、14、20、22的二級質譜圖

3.2 體內原形成分鑒定

結合從消癌解毒方水煎液中鑒定出的黃酮類化合物質譜信息，進而分析其給藥后在大鼠體內的分布情況。結果表明，在大鼠心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、胃、血漿、尿液和糞便中分別鑒定出5、5、3、3、5、6、6、12、3、2和10個黃酮類成分。其中化合物6-甲氧基柚皮素(13)、柚皮素(14)、4′-羥基漢黃芩素(15)、芹菜素(16)和漢黃芩素(19)在多種樣品中被檢出，6-甲氧基柚皮素在所有樣品中被檢測出，柚皮素和芹菜素在心、肝、腎、腸、腦、胃和糞便中被檢出，4′-羥基漢黃芩素在除血漿和尿液外的其他樣品中被檢測出，漢黃芩素在除血漿樣品外的各樣品中均被檢出。詳細信息見表2，相應的質譜圖見圖4。

表2 消癌解毒方黃酮類成分在給藥后大鼠體內的分布

注：A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.腎；F.腸；G.腦；H.胃；I.血漿；J.尿液；K.糞便。圖4 各生物樣品在負離子模式下的總離子流圖

4 討論

當前癌癥發(fā)病率和病死率不斷增長，其發(fā)生發(fā)展與環(huán)境、生活方式、經濟水平等因素有關。目前癌癥的臨床治療以化療為主，但存在化療藥物不良反應較多、易產生耐藥性等問題。相對于單獨化療，消癌解毒方聯(lián)合化學治療可以取得更好的療效，并降低化療藥物的不良反應，提高患者免疫力，提高生活質量[12-14]。本方中半枝蓮為君藥，具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛的功效。半枝蓮水煎液中主要為一些黃酮類化合物[6]。研究顯示，半枝蓮中的4′-羥基漢黃芩素通過破壞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路傳導來抑制結直腸癌血管生成。本實驗中，在半枝蓮及腸組織中均檢測出4′-羥基漢黃芩素成分，說明4′-羥基漢黃芩素能夠到達病灶部位[15]。半枝蓮中的其他黃酮類化合物，如漢黃芩素、野黃芩苷、芹菜素、木犀草素和黃芩素等同樣具有抗腫瘤活性[16-17]。因此本實驗主要研究對象為半枝蓮中黃酮類成分。

近年來液質聯(lián)用技術被廣泛應用于藥物研究中，該技術靈敏度和精密度高、選擇性好，能夠快速發(fā)現(xiàn)和表征目標成分，結合數(shù)據(jù)庫能夠準確鑒定中藥復方復雜體系中的化合物[18]。因此，本實驗運用UPLC-Q-TOF-MS技術對消癌解毒方水提液及大鼠給藥后體內相關部位的黃酮類成分進行分析，闡釋某一類成分在進入體內前后的變化和分布規(guī)律，為下一步研究提供參考和依據(jù)。

本實驗在制備供試品溶液時采用固相萃取技術，使樣品得到凈化和富集，以期得到藥材中更為全面的黃酮類化合物信息。根據(jù)文獻研究，甲醇沉淀蛋白法更快速簡便，取樣量較少，經濟方便[19-20]。為了更快速、方便地檢測樣品，本研究中生物樣本處理采用甲醇沉淀法。而從檢測結果來看，血漿中檢測到的原型成分較其他生物樣品少。究其原因，一方面可能是蛋白沉淀法提取血漿樣品效率不高；另一方面可能是中藥成分吸收入血后在體內不僅會與血漿蛋白結合，還會與組織蛋白等高分子物質結合，某些成分與組織的親和力更好，因此這些藥物在組織中的濃度較血漿中高，而血漿中的藥物濃度過低，低于儀器的檢測限，因此無法檢測到。

消癌解毒方中黃酮類化合物的取代基多為羥基、甲基、甲氧基等，根據(jù)黃酮類化合物的質譜裂解規(guī)律，可以推斷出各環(huán)上存在何種取代基，該方法對于已知目標化合物可實現(xiàn)快速分析，但因取代基位置無法確定，亦存在一定的局限性，特別是對于多種同分異構體的準確分析還需要結合其他技術手段。