薜荔榕小蜂幼蟲蟲齡的劃分

包甜甜, 陳友鈴, 吳文珊,*, 吳婷婷, 張興坦, 周蓮香

(1.福建師范大學生命科學學院, 福建省發(fā)育與神經生物學重點實驗室, 福州 350117;2.福建農林大學海峽聯合研究院基因組與生物技術中心, 福州 350002;3.臺灣大學生態(tài)學與演化生物學研究所, 臺北 10617)

昆蟲幼蟲蟲齡劃分是昆蟲發(fā)育生物學的重要內容，對昆蟲種群年齡結構和發(fā)生時間動態(tài)的研究至關重要。蟲齡劃分包括齡數和齡期的確定，最直接的方法是通過觀察幼蟲蛻皮次數確定齡數，兩次蛻皮之間的時間為齡期，但是這種方法僅適于生長周期短(一般僅為1個月左右)，體型較大(蛻皮現象直觀)，易采樣或可室內飼養(yǎng)的昆蟲；對于幼蟲期發(fā)育期長、體型小、生活場所隱蔽，室內又無法培養(yǎng)的昆蟲幼蟲，其蟲齡劃分則是基于Dyar法則(相鄰蟲齡幼蟲的蟲體的某個部位呈幾何級數增長)測量蟲體某個外部形態(tài)指標(Dyar and Rhinebeck, 1890)，通過頻次分布法分析幼蟲發(fā)育增長規(guī)律進而確定蟲齡，并依據Brooks(1886)、Floater(1996)和Crosby(1973)生長法則輔助推斷?；跍y量的精確性，測量指標首選幼蟲骨化程度較高的部位，例如頭殼、口鉤和頭咽骨(胡隴生等, 2012; 賀春玲等, 2015; Shietal., 2017)等，基于測量的便利性則選擇體長、體寬和周長等作為測量指標(宗世祥等, 2006; 萬喻等, 2015; 曹鵬等, 2018)。

薜荔Ficuspumilavar.pumila為桑科(Moraceae)榕屬Ficus攀援藤本植物，廣布于我國長江以南各省區(qū)，是熱帶和亞熱帶植物生態(tài)系統(tǒng)的關鍵樹種，其瘦果水洗可作涼粉，根莖葉均可入藥。薜荔耐貧瘠，抗干旱，不定根發(fā)達，攀緣及生存適應能力強，是城市垂直綠化的重要樹種。薜荔依賴膜翅目(Hymenoptera)榕小蜂科(Agaonidae)的薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae為其傳粉，二者維持著長期穩(wěn)定的互利共生關系(Chenetal., 2016)。蟲齡劃分是榕小蜂發(fā)生規(guī)律、生物學特性以及榕-蜂共生研究的基礎，但由于榕小蜂的整個幼蟲期都在榕果封閉的環(huán)境中度過，蛻皮難以觀察，幼蟲體長僅數十至數百微米，且無法室內培養(yǎng)，因此，目前關于榕小蜂的分齡方法和分齡標準的研究尚無人報道，均是依據幼蟲形態(tài)特征的差異進行分齡: Jansen-González和Sarmiento(2008)將榕樹Ficusandicola的傳粉榕小蜂Pegoscapusbacataensis幼蟲發(fā)育分為5齡；Jia等(2014)也將對葉榕F.hispida的傳粉榕小蜂Ceratosolensolmsi幼蟲發(fā)育分為5齡；但Yadav和Borges(2017)將聚果榕F.racemosa3種非傳粉榕小蜂Sycophagatestacea、Apocryptasp.2和Apocryptawestwoodi幼蟲發(fā)育劃分為4齡。Jansen-González等(2012, 2014)雖利用頻次分布法確定了榕樹F.citrifolia的傳粉蜂Pegoscapus sp.幼蟲發(fā)育為4齡，以及非傳粉蜂Idarnesflavicollis幼蟲發(fā)育為3齡，但僅作為附錄發(fā)表，沒有蟲齡劃分過程的具體描述。綜上所述，關于榕小蜂幼蟲發(fā)育相關的研究結果少，依據形態(tài)特征進行劃分的榕小蜂蟲齡較為混亂，本研究旨在以頭殼寬、第3節(jié)寬、體長和周長為測量指標，運用統(tǒng)計分析方法確定傳粉榕小蜂幼蟲的齡數和齡期，建立榕小蜂幼蟲蟲齡劃分的方法和標準，為榕小蜂發(fā)育研究，以及榕-蜂協同進化研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2018年7月8日在福建省福州市森林公園(26°15′N, 119°29′E)對薜荔幼果(直徑1.5 cm)進行標記，并用尼龍網袋罩住以防止其他小蜂或昆蟲進入薜荔果內干擾實驗，待果實散發(fā)芳香氣味，打開網袋放入小蜂，標記有小蜂進入的榕果，2 d后開始采樣，采樣時間從2018年7月10日至9月10日。每間隔3 d采集5個已被產卵的薜荔榕果，帶回實驗室，插水培養(yǎng)。

1.2 室內解剖及測量

對半切開薜荔榕果，置于SMZ745T解剖鏡下將蟲癭取出，用昆蟲針將蟲癭劃開，取出小蜂，置于載玻片上，在Olympus SZ61體視顯微鏡下觀察、并利用SteREO Lumar V12成像系統(tǒng)拍照，再用Image-Proplus 5.1顯微測量系統(tǒng)對每頭小蜂幼蟲的頭殼寬、第3節(jié)寬、體長和周長4項指標分別進行測量(圖1)。共測量幼蟲447頭。

圖1 薜荔榕小蜂幼蟲測量示意圖

1.3 數據分析

Crosby指數=(Bn-Bn-1)/Bn-1(其中Bn和Bn-1分別表示第n和n-1個Brooks指數)。

在確定齡數后，參考眾數齡期測定法(戴志一, 1980; Caltagironeetal., 1983; 王小藝等, 2005)確定薜荔榕小蜂各齡的齡期。

2 結果

2.1 薜荔榕小蜂幼蟲的齡數

對447頭薜荔榕小蜂幼蟲頭殼寬、第3節(jié)寬、體長和周長4項指標的測量值進行頻次分布的統(tǒng)計分析，結果表明，4項指標的頻次分布均相對集中在5個區(qū)域：頭殼寬的5個峰值分別在0.04, 0.07, 0.12, 0.19和0.27 mm左右(圖2: A)；第3節(jié)寬的5個峰值分別在0.12, 0.25, 0.40, 0.67和0.85 mm左右(圖2: B)；體長的5個峰值分別在0.24, 0.42, 0.79, 1.31和2.09 mm左右(圖2: C)；周長的5個峰值分別在0.56, 1.01, 1.90, 3.03和4.49 mm(圖2: D)。由此，根據Dyar法則可以斷定，薜荔蜂幼蟲的齡數為5齡。薜荔榕小蜂幼蟲4項分齡指標的均值、標準誤差、變化幅度和變異系數見表1。頭殼寬、體長及周長這3項指標在薜荔榕小蜂不同蟲齡之間的平均值具有顯著差異(P<0.05)，且變異系數均小于20%，Crosby指數均小于10%，表明將薜荔榕小蜂幼蟲分為5齡是合理的。頭殼寬、體長和周長是比較理想的分齡指標；第3節(jié)寬由于其Crosby指數均大于10%且變異系數大于20%，因此不適合作為薜荔榕小蜂幼蟲蟲齡劃分的指標。

表1 薜荔榕小蜂幼蟲各分齡指標的測量結果

圖2 薜荔榕小蜂各齡幼蟲頻次分布圖

2.2 分齡指標測量值與蟲齡之間的相關性

對薜荔榕小蜂幼蟲的頭殼寬、體長和周長3項分齡指標的各齡測量值與相應齡期之間進行回歸分析(圖3)，結果表明，3項指標與蟲齡之間均符合Dyar法則所描述的指數關系，且各分齡指標測量值與蟲齡之間均呈極顯著正相關(P<0.01)，體長測量值與蟲齡回歸曲線的判定系數(R2)最高。因此，體長為分齡的最佳測量指標，同時也進一步表明薜荔榕小蜂幼蟲齡數劃分為5齡是準確的。

圖3 薜荔榕小蜂幼蟲分齡指標和蟲齡之間的回歸關系

2.3 薜荔榕小蜂幼蟲各齡齡期

確定了薜荔榕小蜂幼蟲的齡數后，進一步統(tǒng)計各齡幼蟲不同日期出現數量及對應的累積百分比，將百分數轉化為機值(概率單位，即表2回歸方程中的y)，以機值作為縱坐標(為避免種群中兩端極端數字影響，采用發(fā)育進度12.5%～87.5%之間的數值)，調查日期作橫坐標(表2回歸方程中的x設2018年8月4日等于1)，進行線性回歸分析，計算出各齡的回歸方程式y(tǒng)=a+bx。以機值5(發(fā)育進度=50%)為代表，兩蟲齡直線間的橫坐標距離，即代表該蟲齡的眾數齡期(表2)。薜荔榕小蜂夏季1-5齡幼蟲(圖4)的齡期(L1-L5)分別為4.29, 13.19, 6.27, 24.46和8.90 d，總幼蟲期為57.11 d(表2)。

表2 薜荔榕小蜂各齡幼蟲的齡期計算

圖4 薜荔榕小蜂各齡幼蟲

3 討論

3.1 榕小蜂幼蟲最適分齡指標

由于絕大多數昆蟲幼蟲的頭殼骨化程度高，各齡幼蟲頭殼寬不同，而同齡幼蟲頭殼寬大致固定，因此在昆蟲幼蟲蟲齡劃分的研究中，頭殼寬是最常用的劃分指標(賀春鈴等, 2015; 萬喻等, 2015; Luoetal., 2016; Goetal., 2019)，但薜荔榕小蜂幼蟲微小，1-3齡幼蟲的頭殼寬多小于0.1 mm(且骨化程度不高)，只能通過幼蟲活體拍照后對照片進行測量；拍攝角度不同易造成測量誤差，同時，口器運動和頭部內縮均影響頭殼寬測量的準確性；頭殼寬值比體長和周長小得多，因此相同的標準差，頭殼寬的變異系數(標準差/平均值)較大，易導致分齡的偏差。本研究同時測量幼蟲頭殼寬、第3節(jié)寬、體長和周長4項指標，并經綜合分析，篩選出體長是劃分薜荔榕小蜂幼蟲蟲齡最佳的測量指標。

3.2 榕小蜂幼蟲蟲齡難以劃分的原因

遵循Dyar法則，昆蟲幼蟲相鄰兩個齡期某一部位的長、寬度存在一定的幾何級數關系，那么依據該部位測量值進行頻次分布分析，其頻次分布圖中的一個頻次分布集中區(qū)域即代表一個齡期(Hammacketal., 2003; Calvo and Molina, 2008; 楊美紅等, 2012; Cazadoetal., 2014)。然而，薜荔榕小蜂以頭殼寬、體長和周長的測量值建立的頻次分布均無明顯的分布聚集區(qū)(即無間隔聚集分布)，只能依據波峰與波谷的分布規(guī)律，將連續(xù)的分布區(qū)分出5個區(qū)間，代表5齡(圖2)，并應用Brooks指數、Crosby指數驗證分齡的合理性，其中1齡與2齡幼蟲之間的區(qū)分尤為困難，其中原因有：(1)低齡期幼蟲極其微小(μm級)，小到幾乎進入顯微鏡的測量誤差范圍，從而造成了測量值的高標準差；(2)無法收集在完全相同條件下生長的幼蟲。由于榕小蜂無法人工飼養(yǎng)，我們只能從同一天放蜂的不同的榕果中收集幼蟲，果間幼蟲種群發(fā)育差異可能是導致不同齡期幼蟲分齡指標測量值交疊的主要原因；(3)1齡幼蟲齡期最短，導致1齡和2齡幼蟲分齡指標測量值交疊嚴重，極易造成齡數的誤判，即將5齡誤判為4齡。本研究結果表明以體長為測量指標，利用頻次分布法能夠確定榕小蜂幼蟲的齡數，以眾數齡期測定法能夠確定榕小蜂幼蟲的齡期。

3.3 薜荔榕小蜂齡期的變化

福建地區(qū)的薜荔榕小蜂通常一年產卵2次，春季通常在4月初產卵，產卵時間相對集中，該批次小蜂既為雌花傳粉，也繁育后代，發(fā)育期約3～4個月；秋季小蜂產卵以繁育后代為主，產卵時間分散在7-10月間，于當年年末或翌年出飛，發(fā)育期短者4～5個月，長者達8個月(羅光坦等, 2000; Yangetal., 2017)，實驗室長期觀察數據表明：秋季小蜂發(fā)育的幼蟲期和蛹期均比春夏季長，由此可見，幼蟲的齡期極易隨物候發(fā)生變化，在水熱條件較好的春夏季幼蟲齡期較短，而在寒冷干燥的秋冬季幼蟲齡期較長，同理，幼蟲齡期在不同地理位置、不同海拔高度也將發(fā)生變化，在后續(xù)研究中，我們將進一步關注榕小蜂幼蟲齡期變化的規(guī)律性。