中國北方黑唇苜蓿盲蝽種群遺傳多樣性和遺傳分化分析

王夢琦, 張利娟, 張宏瑞, 孫躍先,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 鄭州 450002)

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因棉花的大面積種植，用于防治棉鈴蟲Helicoverpaarmigera等鱗翅目害蟲的廣譜性殺蟲劑使用頻率降低，導(dǎo)致棉盲蝽、棉薊馬、棉蚜Aphisgossypii、煙粉虱Bemisiatabaci等次要害蟲逐漸上升至主要害蟲。黑唇苜蓿盲蝽Adelphocorisnigritylus屬于半翅目(Hemiptera)盲蝽科(Miridae)苜蓿盲蝽屬Adelphocoris(鄭樂怡, 1998)，是一種重要的棉花害蟲。黑唇苜蓿盲蝽的若蟲和成蟲刺吸棉花的花序、花蕾、雌蕊、雄蕊，造成落花、落蕾、種子發(fā)育不全使棉花大量減產(chǎn)。同時(shí)，黑唇苜蓿盲蝽寄主范圍廣泛，除危害棉花外還危害苜蓿、馬鈴薯等作物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。

群體遺傳學(xué)是遺傳學(xué)中的一個(gè)重要分支，常用于追溯害蟲起源，分析種群歷史動(dòng)態(tài)等研究。了解物種的進(jìn)化歷史可以幫助我們預(yù)測物種應(yīng)對環(huán)境變化的能力，并有利于物種的管理和保護(hù)。寄主和人為干擾是影響種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群動(dòng)態(tài)的兩個(gè)重要因素，如Wei等(2015)在梨小食心蟲Grapholitamolesta的研究中發(fā)現(xiàn)我國北方地區(qū)種群規(guī)模在末次盛冰期后有所擴(kuò)大，這一結(jié)果可能與人類對其寄主植物的栽培活動(dòng)有關(guān)。Cao等(2017)對西花薊馬Frankliniellaoccidentalis的研究表明，在中國西花薊馬種群的遺傳分化是由多次引入和人為媒介的零星擴(kuò)散導(dǎo)致的，與其地理分布無關(guān)。另外，環(huán)境氣候也是影響種群動(dòng)態(tài)的主要因素，Qin等(2018)對世界范圍內(nèi)橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis群體遺傳的研究發(fā)現(xiàn)，在中國境內(nèi)的橘小實(shí)蠅正向中部地區(qū)擴(kuò)張，中國中部地區(qū)的氣候與歐洲和北美溫帶地區(qū)類似并表明橘小實(shí)蠅能夠在溫帶冬季生存。

線粒體DNA作為一種廣泛使用的分子標(biāo)記，常被用于開展群體遺傳學(xué)研究(Aviseetal., 1987; Ballard and Pichaud, 2014)，在中性進(jìn)化假設(shè)下推斷物種的進(jìn)化關(guān)系，分析其群體歷史動(dòng)態(tài)。其中COI,COII,Cytb,ND4和ND5等蛋白質(zhì)編碼基因在群體遺傳學(xué)研究中應(yīng)用頻率較高，如高立志(2014)采用ND4和微衛(wèi)星分子標(biāo)記對我國柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax18個(gè)地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)華南種群是其在我國的擴(kuò)散中心，十堰種群被認(rèn)定為是華南地區(qū)向華中地區(qū)擴(kuò)散的橋頭堡種群。Meng等(2018)使用COI,Cytb和ND5基因的串聯(lián)序列分析柑橘木虱Diaphorinacitri群體遺傳，發(fā)現(xiàn)我國種群的種內(nèi)變異程度低，沒有形成明顯的群體聚類，并顯示其近期發(fā)生了種群擴(kuò)張，作者推測我國柑橘品種及種植面積大幅度增加是擴(kuò)張發(fā)生的主要原因。綜上，已有研究證實(shí)COI,COII,Cytb,ND4和ND5等基因片段可被有效地用于群體遺傳學(xué)研究。

本研究通過對多個(gè)線粒體基因分子標(biāo)記的篩選，最終選取線粒體ND5,ND4和Cytb基因片段用于中國北方地區(qū)黑唇苜蓿盲蝽群體遺傳學(xué)研究，期望明確其遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)等現(xiàn)狀，為實(shí)現(xiàn)該害蟲的綜合防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

本研究所用的黑唇苜蓿盲蝽標(biāo)本于2012-2016年期間采集自中國北方地區(qū)12個(gè)地理種群233頭成蟲，采用掃網(wǎng)法進(jìn)行標(biāo)本的收集，每個(gè)種群設(shè)置3個(gè)以上的取樣點(diǎn)，各個(gè)取樣點(diǎn)之間間隔1 000 m左右，同時(shí)考慮每個(gè)取樣點(diǎn)小生境的差異性，例如寄主植物的種類組成等。樣品收集信息見表1。采集標(biāo)本均用95%酒精保存，并存放于-20℃冰箱中。

表1 黑唇苜蓿盲蝽樣品收集信息

1.2 PCR擴(kuò)增及測序

將黑唇苜蓿盲蝽成蟲標(biāo)本的腹部和翅去除，剩余組織作為提取DNA的實(shí)驗(yàn)材料，使用TIANamp Genomic DNA Kit提取DNA，而后存放于-20℃冰箱中備用。分別以黑唇苜蓿盲蝽線粒體基因組(GenBank登錄號(hào): NC_027144.1)ND5,ND4和Cytb基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物表2，引物由上海生工生物公司合成。

表2 PCR引物

PCR反應(yīng)體系(25 μL): DNA模板(50 ng/μL)2 μL, 正反向引物(10 mol/μL)各1 μL, 2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL, ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性 1 min, 退火1 min(退火溫度:ND5, 50～55℃;ND4, 58～60℃;Cytb, 45～50℃), 72℃延伸1 min, 共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min, 4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，產(chǎn)物純化后送往上海生工生物公司完成雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1種群遺傳多樣性分析：使用SeqMan(Thompsonetal., 1997; Larkinetal., 2007)軟件進(jìn)行正反向序列拼接。然后在GenBank進(jìn)行在線BLAST比對以檢驗(yàn)所得序列的準(zhǔn)確性，通過MEGA 10.0(Kumaretal., 2018)使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列比對，并將核苷酸序列翻譯成氨基酸進(jìn)行校正，檢查序列中間是否有終止密碼子及堿基的插入缺失出現(xiàn)；同時(shí)計(jì)算變異位點(diǎn)等信息以及核苷酸突變率。采用DnaSP 6.0(Rozasetal., 2017)軟件統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目(h)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、變異位點(diǎn)數(shù)(S)、平均核苷酸差異數(shù)(K)等參數(shù)。

1.3.2種群遺傳結(jié)構(gòu)分析：利用SAMOVA 1.0(Dupanloupetal., 2002)對不同地理種群間的空間變異進(jìn)行分析，分組數(shù)從2依次增加到15，每次分組計(jì)算均進(jìn)行100次的置換撿驗(yàn)。利用Arlequin 3.5(Excoffier and Lischer, 2010)分別計(jì)算種群間、種群內(nèi)、組間和組內(nèi)個(gè)體間的遺傳變異情況，進(jìn)行10 000次置換以檢驗(yàn)顯著性水平。利用Arlequin軟件中的Tamura and Nei模型(Tamura and Nei, 1993)計(jì)算種群間成對的遺傳分化指數(shù)(Fst)矩陣，并將其轉(zhuǎn)換為Fst/1-Fst，利用各地理種群的經(jīng)緯度信息計(jì)算種群間的直線地理距離(km)矩陣，將其轉(zhuǎn)換為對數(shù)形式，通過NTSYSpc 2.10e(Rohlf, 1998)軟件進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，即種群間遺傳距離與地理距離的相關(guān)性。

1.3.3系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系：通過MEGA 10.0以三點(diǎn)苜蓿盲蝽Adelphocorisfasciaticollis線粒體基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NC_023796.1)作為外群構(gòu)建單倍型發(fā)育樹，使用Kimura 2-Parameter模型，系統(tǒng)發(fā)育分支的置信度通過自展檢驗(yàn)獲得并進(jìn)行1 000次重復(fù)檢測。使用PopART 1.7軟件(Leigh and Bryant, 2015)，以中介網(wǎng)絡(luò)(median-joining network)法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，推測各個(gè)單倍型間的進(jìn)化關(guān)系。

1.3.4歷史動(dòng)態(tài)分析：采用DnaSP 6.0軟件分別對己劃分組和所有樣本進(jìn)行分析，計(jì)算Fu and Li’sF*和Fu and Li’sD*值(Fu and Li, 1993)；利用Arlequin軟件計(jì)算Fu’sFs和Tajima’sD值，通過這些參數(shù)檢驗(yàn)種群是否偏離中性進(jìn)化模型。使用Arlequin軟件進(jìn)行錯(cuò)配分布分析，推斷種群是否發(fā)生擴(kuò)張，同時(shí)對觀測到的錯(cuò)配分布進(jìn)行平滑指數(shù)和錯(cuò)配分布預(yù)測值和觀測值間方差總和的計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 種群線粒體基因序列

本研究最終獲得線粒體ND5,ND4和Cytb基因片段可用序列各233條(GenBank登錄號(hào): MT862031-MT862129)。單獨(dú)分析各線粒體基因時(shí)，ND5基因序列長度為858 bp，檢測出33個(gè)單倍型，單倍型多樣性(Hd)為0.770；ND4基因序列長度為804 bp，檢測出34個(gè)單倍型，單倍型多樣性(Hd)為0.806；Cytb基因序列長度為816 bp，檢測出32個(gè)單倍型，單倍型多樣性(Hd)為0.780。無插入和缺失位點(diǎn)，排除假基因的可能后，將3個(gè)線粒體基因片段(ND5: 858 bp;ND4: 804 bp和Cytb: 816 bp)串聯(lián)后進(jìn)行綜合分析, 串聯(lián)序列長度為2 226 bp。在串聯(lián)序列中共檢測到141個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，占序列長度的5.69%，其中簡約信息位點(diǎn)為88個(gè)，單一變異位點(diǎn)為53個(gè)。堿基組成分析發(fā)現(xiàn)，A=29.7%, T=45.9%, G=13.5%, C=10.9%，A+T含量為56.8%，明顯大于G+C含量(43.2%)，堿基組成表現(xiàn)出了明顯的偏倚，符合昆蟲線粒體基因序列的堿基組成特點(diǎn)。在串聯(lián)序列中共檢測到87個(gè)單倍型，其中Hap3被47個(gè)個(gè)體所共享，Hap9被35個(gè)個(gè)體所共享，Hap8被22個(gè)個(gè)體所共享。

2.2 種群遺傳多樣性

從串聯(lián)序列分析可以看出(表3)，12個(gè)黑唇苜蓿盲蝽種群均顯示出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，各個(gè)種群間存在一定的多態(tài)性差異：各種群序列變異位點(diǎn)數(shù)(S)范圍為5～63，單倍型數(shù)目(h)范圍為2～15，單倍型多樣性(Hd)范圍為0.596～0.939，核苷酸多樣性(π)為0.00083～0.00687，平均核苷酸差異數(shù)(K)為2.067～17.013。河北衡水種群(HS)顯示出相對較高的遺傳多樣性，其單倍型數(shù)目為15、核苷酸多樣性為0.00687、平均核苷酸差異數(shù)為17.013。河北衡水種群(HS)、山東德州種群(DZ)、山東菏澤種群(HZ)單倍型多樣性較高，分別為0.939, 0.937和0.933。山東德州種群(DZ)、河北衡水種群(HS)、遼寧鐵嶺種群(TL)、黑龍江綏化種群(SH)序列變異位點(diǎn)數(shù)最高，分別為63, 61, 58和54。山東濰坊種群(WF)單倍型多樣性最低，為0.596，同時(shí)單倍型數(shù)目較少。

表3 基于線粒體基因ND5, ND4和Cytb串聯(lián)序列的中國北方黑唇苜蓿盲蝽種群遺傳多樣性和種群歷史動(dòng)態(tài)參數(shù)

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

基于串聯(lián)序列的分析，12個(gè)種群兩兩之間的Fst值為-0.06880～0.82926(表4)。河北廊坊種群(LF)與其余11個(gè)種群存在顯著的遺傳差異，山東德州種群(DZ)與另外6個(gè)種群的遺傳分化較高。但陜西商洛種群(SL)、河北涿州種群(ZHZ)和河南鄭州種群(ZZ)兩兩之間的Fst值較低，分別為-0.00249(SL-ZHZ),-0.00297(SL-ZZ)和0.00230(ZHZ-ZZ)。

表4 基于線粒體基因ND5, ND4和Cytb串聯(lián)序列的中國北方黑唇苜蓿盲蝽種群間遺傳分化指數(shù)(Fst)

SAMOVA分析結(jié)果如下(圖1)：當(dāng)K=2到3時(shí)，組間遺傳差異FCT值呈上升趨勢，當(dāng)K=3～6時(shí)呈緩慢下降的趨勢；K=7～9，F(xiàn)CT值呈緩慢上升的趨勢，組內(nèi)種群間和種群內(nèi)遺傳差異值FSC與FST在K=2～9時(shí)呈明顯下降趨勢。結(jié)合種群間遺傳差異分析結(jié)果和SAMOVA分析，作者選取K=5作為最佳分組數(shù)量，第1組包括河北廊坊種群(LF)，第2組包括黑龍江綏化種群(SH)，第3組包括北京朝陽種群(BJ)、吉林松原種群(SY)、遼寧鐵嶺種群(TL)，第4組包括河北涿州種群(ZHZ)、河北衡水種群(HS)、河南鄭州種群(ZZ)、山東淮坊種群(WF)、陜西商洛種群(SL)，第5組包括山東德州種群(DZ)、山東菏澤種群(HZ)。組間遺傳差異分析均達(dá)到顯著水平(表5)，其中，第1組與第5組間遺傳差異最大,為0.60978(P<0.001)；第1和第4組間的遺傳差異較小,為0.25891(P<0.01)。SAMOVA分析結(jié)果顯示組間的變異為17.09%，組內(nèi)的變異為82.91%，表明黑唇苜蓿盲蝽的遺傳分化主要表現(xiàn)為組內(nèi)分化。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示種群間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關(guān)性(r=-0.02735,P=0.4310)。

圖1 基于線粒體基因ND5, ND4和Cytb串聯(lián)序列的中國北方黑唇苜蓿盲蝽種群固定指數(shù)(F)隨著分組組數(shù)(K)的變化

表5 基于線粒體基因ND5, ND4和Cytb串聯(lián)序列的中國北方黑唇苜蓿盲蝽種群組間遺傳分化指數(shù)(Fst)

2.4 單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，同一種群包含的單倍型并沒有聚到同一支系中，而是相互混雜聚在一起，單倍型間許多屬于多分歧分支，進(jìn)化關(guān)系不明顯(圖2)。單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化關(guān)系顯示(圖3)，單倍型分化節(jié)點(diǎn)和共享頻率迥異，其中Hap3, Hap5, Hap8, Hap9和Hap48位于單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的中間位置，其余單倍型則是由原始單倍型通過一次或幾次突變形成并分布在其他種群中，部分單倍型之間通過缺失的中間單倍型相互連接。在高頻率共享單倍型中，Hap3被4個(gè)組群(除第2組)共享，Hap8和Hap9分別被第2, 3和4組及第3, 4和5組各3個(gè)組群所共享。該單倍型關(guān)系圖與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致，各單倍型相互散布在不同的地理種群中，未形成明顯的系統(tǒng)地理格局。

圖3 基于線粒體基因ND5, ND4和Cytb串聯(lián)序列的中國北方黑唇苜蓿盲蝽種群單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 種群歷史動(dòng)態(tài)

中性檢驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，將12個(gè)種群作為一個(gè)整體進(jìn)行分析時(shí)，F(xiàn)u and Li’sF*和Fu and Li’sD*為顯著負(fù)值，而 Fu’sFs和Tajima’sD為負(fù)值但未達(dá)顯著水平。當(dāng)以組為單位進(jìn)行分析時(shí)，第1組和第5組Tajima’sD, Fu and Li’sF*和Fu and Li’sD*均為顯著負(fù)值，而 Fu’sFs為負(fù)值且未達(dá)顯著水平；第3組的結(jié)果同整體分析一致；第4組Fu’sFs和Fu and Li’sF*和Fu and Li’sD*均為顯著負(fù)值，而Tajima’sD為負(fù)值但未達(dá)顯著水平。單獨(dú)對種群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，河北廊坊種群(LF)只有Fu’sFs為負(fù)值且不顯著，其余3個(gè)參數(shù)均為顯著負(fù)值；遼寧鐵嶺種群(TL)和山東淮坊種群(WF)有兩個(gè)參數(shù)顯著負(fù)值；山東德州種群(DZ)和山東菏澤種群(HZ)均有一個(gè)參數(shù)為顯著負(fù)值。整體種群的錯(cuò)配分析(圖4)呈單峰，SSD和HR指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 基于線粒體基因ND5, ND4和Cytb串聯(lián)序列的中國北方黑唇苜蓿盲蝽種群的錯(cuò)配分析圖

3 討論

遺傳多樣性是由核苷酸序列發(fā)生改變引起的，其中單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)常被作為評價(jià)物種遺傳多樣性的重要指標(biāo)，通常單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性參數(shù)值越大，表明物種種群遺傳多樣性越高。本研究黑唇苜蓿盲蝽種群擁有高的單倍型多樣性(Hd=0.924)和低的核苷酸多樣性(π=0.00424)，與已發(fā)表中黑盲蝽Adelphocorissuturalis、煙盲蝽Nesidiocoristenuis和黑唇苜蓿盲蝽遺傳多樣性結(jié)果(Zhangetal., 2015; Xunetal., 2016; 張利娟等, 2018)相似。按照Grant和Bowen(1998)提出的基于單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)推測種群進(jìn)化歷史的標(biāo)準(zhǔn)，通常Hd≥0.5且π<0.5%時(shí)，是由于種群經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后迅速膨脹所致。作者推測出現(xiàn)上述現(xiàn)象的主要原因是由于黑唇苜蓿盲蝽種群近期呈現(xiàn)快速增長的模式，核苷酸突變累積時(shí)間不足造成的(Frankham, 1996; Cooketal., 1997;Grant and Bowen, 1998)。種群間遺傳分化指數(shù)(Fst)顯示黑唇苜蓿盲蝽組間遺傳分化程度較低，Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示遺傳距離和地理距離兩者不具有相關(guān)性。這一結(jié)果說明我國不同地理與氣候條件不是影響黑唇苜蓿盲蝽遺傳分化的主要因素。整體上黑唇苜蓿盲蝽未出現(xiàn)明顯的寄主不連續(xù)分布現(xiàn)象，同時(shí)，氣候屏障對黑唇苜蓿盲蝽存活率及有效種群數(shù)量影響也較小，推測這些可能是導(dǎo)致中國北方地區(qū)黑唇苜蓿盲蝽較小遺傳分化的主要原因。

種群歷史動(dòng)態(tài)分析顯示，當(dāng)把所有種群作為一個(gè)整體進(jìn)行分析時(shí)，相關(guān)參數(shù)均為負(fù)值，其中Fu and Li’sF*和Fu and Li’sD*為顯著負(fù)值(表3)，表明黑唇苜蓿盲蝽種群近期可能經(jīng)歷了擴(kuò)張(Lietal., 2015)。錯(cuò)配分析結(jié)果同樣證明，黑唇苜蓿盲蝽經(jīng)歷過種群的增長，發(fā)生過種群擴(kuò)張(Cristianoetal., 2016)。寄主植物種類和數(shù)量是影響昆蟲生命活動(dòng)的主要因素，生態(tài)環(huán)境中高的寄主豐富度會(huì)增加昆蟲的生存力和繁殖力使種群發(fā)生擴(kuò)張。根據(jù)近年來棉花種植結(jié)構(gòu)和面積的調(diào)整及棉盲蝽寄主廣泛這一特點(diǎn)，可能出現(xiàn)由棉花經(jīng)野生寄主或由棉花直接向其他作物擴(kuò)散的情況，如Demirel(2009)在研究中發(fā)現(xiàn)曾經(jīng)危害較輕的寄主作物油菜上苜蓿盲蝽種群密度顯著增加密集的現(xiàn)象，類似的作物種群也可為黑唇苜蓿盲蝽提供了更多的食物選擇和適宜的生存環(huán)境，作者推測寄主豐富度的增加是其發(fā)生種群擴(kuò)張?jiān)蛑?Mengetal., 2018)。此外，黑苜蓿盲蝽的卵以棉花、馬鈴薯等農(nóng)作物為載體，通過人為干擾或寄主植物攜帶的形式從而進(jìn)行長距離擴(kuò)散傳播也是導(dǎo)致種群擴(kuò)張的原因之一(李繼強(qiáng)等, 2015; Caoetal., 2017)。