生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝的狂犬病毒疫苗研究進(jìn)展

劉文凱，王家敏，喬自林＊

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

狂犬?。≧abies）俗稱“瘋狗病”，是由狂犬病毒引起的人畜共患的傳染病，其發(fā)病期會(huì)持續(xù)數(shù)月或數(shù)年，病毒感染周邊神經(jīng)直至脊髓，并迅速擴(kuò)散至大腦，引發(fā)致命性的腦炎，最終導(dǎo)致宿主死亡[1]。全球每年因感染狂犬病毒導(dǎo)致死亡的超過50 000人，且大部分發(fā)生在亞洲。目前臨床上還沒有治療狂犬病的有效措施，通?；颊甙l(fā)病后會(huì)在3～6 d內(nèi)因呼吸或循環(huán)衰竭而死亡。

狂犬病毒早在1884年病毒發(fā)現(xiàn)之前，法國科學(xué)家巴斯德就發(fā)明了狂犬疫苗。巴斯德第一次采用疫苗來治療被咬傷的人類患者，是利用被狂犬病毒侵染的兔子的脊髓漿液。后來逐漸發(fā)展成為使用動(dòng)物腦組織疫苗，此種疫苗預(yù)防效果井不太理想，且疫苗內(nèi)含有大量的非特異性腦組織成分，可能發(fā)生較大的局部與全身性不良反應(yīng)。細(xì)胞培養(yǎng)工藝狂犬病疫苗的問世，解決了組織疫苗的缺陷。生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)工藝相比，可使單位體積內(nèi)有效細(xì)胞數(shù)量增加，且生產(chǎn)流程及過程自動(dòng)化程度高，不僅減少了污染細(xì)胞的機(jī)會(huì)，同時(shí)減少人為操作因素影響，已成為疫苗生產(chǎn)的主流工藝。本文對我國生物反應(yīng)器生產(chǎn)狂犬病毒疫苗的工藝進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。

1 全懸浮培養(yǎng)工藝

全懸浮培養(yǎng)指的是在受到不斷攪動(dòng)或搖動(dòng)的液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)系統(tǒng)，是非貼壁依賴性細(xì)胞的一種培養(yǎng)方式。某些貼壁依賴性細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)和馴化也可用此方法培養(yǎng)。在20世紀(jì)70年代就有利用懸浮生長的 BHK 細(xì)胞感染 Flury LEP 株病毒生產(chǎn)滅活的獸用狂犬疫苗的報(bào)道[2]。20世紀(jì)90年代后, 法國巴斯德研究所將生物反應(yīng)器應(yīng)用于BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，制備了實(shí)驗(yàn)狂犬病疫苗[3]。而國內(nèi)懸浮培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)雖起步較晚，但已迎頭趕上。金宇保靈利用BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制造獸用狂犬滅活凍干疫苗，在生物反應(yīng)器中按照0.2～0.5×106cell/ml接種BHK21-C13細(xì)胞，在轉(zhuǎn)速60～110rpm、DO20%～60%時(shí)接入狂犬病毒生產(chǎn)種毒進(jìn)行培養(yǎng)，獲得高滴度的病毒原液，克服了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中工藝繁瑣、抗原含量低和效力低等技術(shù)難題[4]。青島蔚藍(lán)在此基礎(chǔ)上利用對BHK21細(xì)胞進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，先用5%血清培養(yǎng)基適應(yīng)，再逐漸降低血清含量后連續(xù)馴化，待細(xì)胞完全適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)基后，在轉(zhuǎn)速80r/min、培養(yǎng)溫度37℃和溶氧30%～45%的條件下采用半連續(xù)流加方式培養(yǎng)，細(xì)胞活力高于95%，密度達(dá)到5×106cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于108LogLD50/ml[5]。北京生科利用連續(xù)灌流培養(yǎng)，在細(xì)胞密度達(dá)到2～4×106cell/ml時(shí)，用狂犬病毒株P(guān)V/BHK-21進(jìn)行病毒感染，可以多次收獲病毒，滴度達(dá)107.5LogLD50/ml。收獲的病毒原液進(jìn)行過濾系統(tǒng)處理和滅活，可制成免疫性高、安全性好的狂犬病滅活疫苗，且利用無血清培養(yǎng)，可避免血清源性污染，簡化提純程序，降低血清引起的機(jī)體過敏性反應(yīng)[6]。蘇州世諾采用SEQ ID NO:1的核酸分子編碼的狂犬病毒G蛋白，通過生物反應(yīng)器無血清懸浮培養(yǎng)制備疫苗，疫苗的抗原性、免疫原性與天然蛋白質(zhì)相似，表達(dá)水平較高，對動(dòng)物沒有致病性，大大降低了生產(chǎn)成本[7]。

2 微載體培養(yǎng)工藝

微載體以微小顆粒作為細(xì)胞貼附的載體，可提供相當(dāng)大的貼附面積。由于體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可使得細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，最終能夠使細(xì)胞在載體表面繁殖成單層的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。黃仕和等利用25代CTN—IV的狂犬毒株在126代Vero細(xì)胞種子上傳代，并從方瓶—轉(zhuǎn)瓶,再逐步培養(yǎng)至50L生物反應(yīng)器，傳代毒力基本上穩(wěn)定在7.0 LogLD50/ml以上[8]。李平忠等人以146代的Vero細(xì)胞接種于7L反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，在參數(shù)為溫度37℃、pH7.2、溶氧50%空氣飽和度、攪拌速度50r/min時(shí)，微載體加量分別為：3g/L、4g/L和6g/L，采用灌流法培養(yǎng)，接種狂犬病毒aG株病毒，最終病毒滴度達(dá)106LogLD50/ml，最高效價(jià)為6.49IU/ml[9]。采用激流式生物反應(yīng)器（AP20C）紙片載體培養(yǎng)BHK－21細(xì)胞，生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)的參數(shù)為溫度36.5℃、pH7.0、DO50%、振蕩器速度60rpm/min時(shí)，在培養(yǎng)72～144h后接入Flury株，lgLD50平均為5.75/0.03ml。張家友比較了微載體與片狀載體培養(yǎng)MDCK-G1細(xì)胞的效果，在攪拌轉(zhuǎn)速55r／min，初始細(xì)胞接種密度3×105cell／ml，載體量8g／L的條件下，微載體培養(yǎng)最高細(xì)胞密度為（5.03±0.12）×106cell／ml；而片狀載體在攪拌轉(zhuǎn)速120r／min，初始細(xì)胞接種密度2×105cell／ml，載體量200g的條件下，最高細(xì)胞密度為（10.22±0.69）×106cell／ml[10]。相比轉(zhuǎn)瓶傳統(tǒng)方法，微載體系統(tǒng)可以提供極高的表面積與體積比，增加病毒產(chǎn)量，并且顯著減少所需傳統(tǒng)培養(yǎng)容器的數(shù)量，節(jié)約空間和成本。

3 片狀載體培養(yǎng)工藝

片狀載體培養(yǎng)是在反應(yīng)器中填充一定材質(zhì)的填充物，供細(xì)胞貼壁生長。袁延寶等用15L生物反應(yīng)器采用片狀載體對Vero細(xì)胞培養(yǎng)，采用批次培養(yǎng)和連續(xù)灌流培養(yǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，密度均達(dá)到6×106cell/ml以上，病毒收獲液的毒力滴度可以達(dá)到7.0～8.0 LogLD50/ml之間[11]，王輝等利用籃式反應(yīng)器細(xì)胞消化的方法，在溫度36.5±1℃、pH7.2～7.4、DO 40%～70%、攪拌速度50～90r/min時(shí)，收獲細(xì)胞懸液，此方法可實(shí)現(xiàn)籃式反應(yīng)器Vero細(xì)胞培養(yǎng)工藝的逐級(jí)放大[12]除Vero細(xì)胞以外，武漢賽科采用片狀載體袋在溫度37℃、PH7.2、溶解氧50%、擺床角度6～9°，速度10～30rmp/min直接進(jìn)行原代CEF細(xì)胞培養(yǎng)，然后接入狂犬病毒培養(yǎng)解決了宿主細(xì)胞DNA殘留問題。臺(tái)灣賽宇在具有固定床籃式攪拌系統(tǒng)的Celligen310型14L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，按照接種密度0.5～2×106cells/ml，溫度30～35℃、溶氧20%～90%、葡萄糖濃度25～40um、攪拌速率20～100rpm/min培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)5×108cell/ml，病毒滴度呈大幅度對數(shù)增加，最高可達(dá)1×109FFU/ml，可大批量生產(chǎn)狂犬疫苗[13]。另外，片狀載體袋通過前后或左右擺動(dòng)來進(jìn)行傳氧，在培養(yǎng)過程中使擺床靜態(tài)和動(dòng)態(tài)相結(jié)合，傳質(zhì)傳氧效率高[14]。上海楚鯤制造的新型片狀載體中的頁片向外張開，并采用載體床層和攪拌槳的新穎結(jié)合方式在簡單更換攪拌槳的情況下可多種培養(yǎng)[15]，廣州諾誠采用的生物反應(yīng)器片狀載體清洗裝置，通過把片狀載體裝入合適的尼龍網(wǎng)袋中后放入載體清洗儀中，設(shè)定清洗時(shí)間、清洗次數(shù)和進(jìn)水量可以實(shí)現(xiàn)載體的清洗工作，可實(shí)現(xiàn)片狀載體的回收利用，極大的降低生產(chǎn)成本[16]，與采用微載體的罐培養(yǎng)工藝相比，片狀載體可以將細(xì)胞固定在一個(gè)相對平穩(wěn)的環(huán)境中，因此不會(huì)受到攪拌系統(tǒng)剪切力的影響而造成細(xì)胞脫落，細(xì)胞培養(yǎng)液的交換更加充分，有利于pH和DO的調(diào)控，并在收獲病毒液過程中使得脫落細(xì)胞減少，有利于疫苗的純化[13]。

4 展望

近幾年，新型重組疫苗、植物疫苗、DNA疫苗和G蛋白亞單位疫苗的多肽疫苗的研究有較好進(jìn)展，有望替代全病毒疫苗。疫苗對狂犬病毒感染后預(yù)防有較好效果，但想要從根本上控制人狂犬病的發(fā)病率，開發(fā)使用簡便，成本低廉的口服疫苗在野外大范圍投放，才能真正做到從源頭遏制狂犬病毒。