基于顯微圖像的測定值與火腿腸中蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉含量及感官評分間的相關(guān)性研究

朱林韜 吳文標(biāo)

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716)

中國是肉類工業(yè)大國，2016年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量(3.299×108t)近30%[1]；所產(chǎn)肉制品占肉類產(chǎn)量的17%。火腿腸是一種肉質(zhì)細(xì)膩、鮮嫩爽口的即食食品，是中國重要的肉制品；據(jù)報(bào)道[2]，2013年僅雙匯、金鑼和雨潤幾家企業(yè)生產(chǎn)的火腿腸就占中國肉制品產(chǎn)量的40%～60%。為了規(guī)范管理火腿腸行業(yè)的市場，原中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)聯(lián)合于2006年 12月11日發(fā)布了GB/T 20712—2006火腿腸國家標(biāo)準(zhǔn)；該標(biāo)準(zhǔn)于2007年06月01日起實(shí)施。此國家標(biāo)準(zhǔn)對火腿腸的主要營養(yǎng)成分脂肪、淀粉及蛋白質(zhì)作出了強(qiáng)制性的規(guī)定，并以這3種營養(yǎng)成分的含量為標(biāo)準(zhǔn)將其劃分有普通級、優(yōu)級和特級3個(gè)級別。同時(shí)對火腿腸的感官品質(zhì)也有要求。

在進(jìn)行火腿腸的生產(chǎn)以及在其市場監(jiān)督與管理過程中，檢驗(yàn)和判斷產(chǎn)品是否合格就必須對脂肪、淀粉及蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測定。特別是為了保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益判定產(chǎn)品的級別是否達(dá)標(biāo)也是必須要做的工作。過去已發(fā)表的一些文獻(xiàn)[3-5]對火腿腸品質(zhì)的評價(jià)方法進(jìn)行了有益的探索。至今為止，對火腿腸中脂肪、淀粉及蛋白質(zhì)的含量仍然是采用化學(xué)方法進(jìn)行測定[6]?；瘜W(xué)方法耗時(shí)而且需要用到危險(xiǎn)的化學(xué)藥品。

近年來，顯微照相技術(shù)在其它領(lǐng)域已有應(yīng)用，例如，識別蛋白以快速檢驗(yàn)酵母菌總數(shù)[7]、識別馬鈴薯淀粉以研究其糊化特性[8]，但是在火腿腸的品質(zhì)評價(jià)方面尚未見有應(yīng)用報(bào)道。本研究擬利用顯微照相技術(shù)快速地測定火腿腸中蛋白質(zhì)、脂類和淀粉的含量；結(jié)合該技術(shù)觀察到的微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)及感官評分聚類分析火腿腸是否達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)級別。以期將該技術(shù)應(yīng)用于火腿腸的生產(chǎn)和市場監(jiān)督管理中，為指導(dǎo)開發(fā)便攜式的快速照相儀以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 原材料

特優(yōu)級、優(yōu)級、普通級豬肉火腿腸：雙匯牌，產(chǎn)于四川省綿陽市，購自北碚永輝超市。

1.2 試劑

無水乙醇、二甲苯、中性樹膠：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

PAS +萘酚黃S染液套裝、固定液、油紅染液、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、甘油明膠封片劑：分析純，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

脫水機(jī)：JJ-12J型，武漢俊杰電子有限公司；

包埋機(jī)：JB-P5型，武漢俊杰電子有限公司；

病理切片機(jī)：RM2016型，上海徠卡儀器有限公司；

凍臺：JB-L5型，武漢俊杰電子有限公司；

組織攤片機(jī)：KD-P型，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；

烤箱：GFL-230型，天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司；

正置光學(xué)顯微鏡：NIKON ECLIPSE E100型，日本尼康公司；

成像系統(tǒng)：NIKON DS-U3型，日本尼康公司；

冰凍切片機(jī)：CRYOSTAR NX50型，美國賽默飛世爾公司；

切片刀：LEICA 819型，上海徠卡儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 油紅O染色方法

(1) 新鮮冰凍切片固定：將冰凍切片復(fù)溫干燥后，在固定液中固定15 min，再用蒸餾水清洗、晾干。

(2) 油紅染色：將切片放入油紅染液浸染8～10 min(加蓋避光)后，用蒸餾水清洗。

(3) 背景分化：用75%酒精稍分化后，再用蒸餾水清洗。

(4) 蘇木素染色：將切片放入蘇木素染液染3～5 min后，用自來水清洗；再用分化液分化，用自來水清洗；用返藍(lán)液進(jìn)行返藍(lán)后，用流水沖洗。

(5) 封片：甘油明膠封片劑封片。

最后用顯微鏡放大20或200倍分別進(jìn)行鏡檢，采集圖像并分析(拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致)[9-11]。

1.4.2 PAS +萘酚黃S染色方法

(1) 石蠟切片脫蠟至水中：依次將切片放入二甲苯Ⅰ中20 min、二甲苯Ⅱ中20 min、無水乙醇Ⅰ中5 min、無水乙醇Ⅱ中5 min和75%酒精中5 min，然后用自來水洗。

(2) 高碘酸染色：將切片放入高碘酸染液中染色15 min，用自來水洗，然后用蒸餾水洗2遍。

(3) 雪弗染色：再將切片放入雪弗染液中20～30 min，要求避光，然后用流水沖洗5 min。

(4) 萘酚黃S染色：接著將切片用蒸餾水洗2遍，在萘酚黃S中浸染2 min，用蒸餾水快洗后，再用無水乙醇進(jìn)行2次脫水。

(5) 脫水封片：將切片放入無水乙醇中5 min、二甲苯中5 min透明化，用中性樹膠封片。

最后用顯微鏡放大20或200倍分別進(jìn)行鏡檢，采集圖像并分析(拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致)。

1.4.3 化學(xué)分析方法

(1) 蛋白質(zhì)：按GB/T 5009.5—2016執(zhí)行。

(2) 脂肪：按GB/T 5009.6—2016執(zhí)行。

(3) 淀粉：按GB/T 5009.9—2016執(zhí)行。

1.4.4 火腿腸感官評定方法 在火腿腸的結(jié)構(gòu)感官評分中有60名人員參加了評價(jià)，男性和女性分別占50%；嘗試了總共60根含淀粉的豬肉火腿腸(3個(gè)等級；每個(gè)等級20根)[12-13]。要求所有小組成員填寫表格并在品嘗樣品后進(jìn)行感官愉悅評分。其中-4=極度討厭，-3=非常討厭，-2=中度討厭，-1=略微討厭，0=既不討厭也不喜歡，1=略微喜歡，2=中度喜歡，3=非常喜歡，4=極度喜歡。將每個(gè)等級的每根火腿腸的一半切取10片5 mm厚的切片，然后將10片火腿腸切片分別放在匿名編碼的盤子上，并以隨機(jī)順序呈現(xiàn)給每位評分成員。在評分之前，所有小組成員都進(jìn)行了口頭簡報(bào)，并且給他們有書面說明，以避免回味影響對結(jié)構(gòu)的正確評分(通過飲用水進(jìn)行漱口3次)。

對剩余的每個(gè)火腿腸的另一半用顯微照相技術(shù)進(jìn)行照相和分析。

1.4.5 火腿腸等級劃分方法 依據(jù)GB/T 20712—2016標(biāo)準(zhǔn)劃分：Ⅰ為普通級火腿腸；Ⅱ?yàn)閮?yōu)級火腿腸；Ⅲ為特優(yōu)級火腿腸。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

對所得的數(shù)據(jù)利用Excel 2003和SPSS 19.0進(jìn)行處理(包括回歸分析和顯著性檢驗(yàn))，對顯微圖片利用Image-pro plus 6.0進(jìn)行處理，利用MatlabR2015b進(jìn)行K-means聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 火腿腸顯微觀察

2.1.1 火腿腸切片的油紅O染色 關(guān)于脂肪染色后顯微放大200倍所得的照片如圖1所示。油紅O染色區(qū)域脂肪呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，質(zhì)間無色，結(jié)構(gòu)清晰細(xì)胞形態(tài)良好。

應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對每一級別火腿腸切片放大20倍的3張重復(fù)照片中的紅色脂滴面積所占像素及其占總觀察視野像素的百分比進(jìn)行了測定和計(jì)算分析，所得的結(jié)果見表1。單因素方差分析(F-檢驗(yàn))結(jié)果表明3次測定結(jié)果之間沒有差異性(P>0.05)，采用分析化學(xué)可疑值判定方法確定3次測定結(jié)果中沒有離散(群)值；3種不同等級火腿腸染色切片中的紅色脂滴面積所占像素及其占總觀察視野像素的百分比差異顯著(P=0.013<0.05)，具有數(shù)理統(tǒng)計(jì)意義。

圖1 火腿腸切片中脂肪染色照片 (放大200倍)Figure 1 Photos of fat stained in slices of ham sausage(magnified 200 times)

表1火腿腸切片中脂肪染色所占像素及其占總觀察視野像素的百分比(放大20倍)?

Table 1 Pixels of fat stained in slices of ham sausages and their percentage accounted for the total pixels (magnified 20 times;n=3)

級別紅色脂滴所占像素脂滴所占像素占視野總像素的百分比/%Ⅰ2 681 173.4±2 308.611.11±0.19aⅡ3 448 266.6±20 301.814.13±0.95bⅢ3 175 950.0±2 536.712.94±0.33c

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；視野總像素為24 576 000。

2.1.2 火腿腸切片的PAS+萘酚黃S染色 關(guān)于蛋白質(zhì)和淀粉染色后顯微放大200倍所得的照片如圖2所示。在照片中的PAS+萘酚黃S染色區(qū)域里淀粉呈紫紅色，蛋白質(zhì)呈黃色，結(jié)構(gòu)清晰，切片形態(tài)良好。

應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件，對每一級別火腿腸切片放大20倍的3張重復(fù)照片中呈紫色淀粉面積所占像素及其占觀察視野總像素的百分比，呈黃色蛋白質(zhì)面積所占像素及其占觀察視野總像素的百分比分別進(jìn)行了測定和計(jì)算分析，所得的結(jié)果見表2。單因素方差分析(F-檢驗(yàn))結(jié)果表明與蛋白質(zhì)或淀粉染色面積所占像素等相關(guān)的3次測定結(jié)果之間沒有差異性(P>0.05)，采用分析化學(xué)可疑值判定方法確定3次測定結(jié)果中沒有離散(群)值；3種染色切片中的黃色蛋白面積所占像素及其占總觀察視野像素的百分比差異顯著(P=0.044<0.05)或紫色淀粉面積所占像素及其占總觀察視野像素的百分比差異顯著(P=0.013<0.05)，具有數(shù)理統(tǒng)計(jì)意義。

圖2 火腿腸切片中淀粉和蛋白質(zhì)染色照片 (放大200倍)

Figure 2 Photos of starch and protein stained in slices of ham sausage (magnified 200 times)

2.2 火腿腸顯微觀察結(jié)果在其品質(zhì)評價(jià)中的應(yīng)用

2.2.1 照相測定染色面積百分比法測定主要營養(yǎng)成分的含量 通過比較特優(yōu)級、優(yōu)級和普通級火腿腸的主要營養(yǎng)成分的照相測定結(jié)果(染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比)與化學(xué)測定結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)它們之間具有線性相關(guān)性。通過線性回歸分析得到火腿腸切片中淀粉的染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比與其含量的線性回歸方程為：Y=18.145+3.071X(R2=0.916，r=0.957)，蛋白質(zhì)的染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比與其含量的線性回歸方程為：Y=-21.752+2.993X(R2=0.912，r=0.955)，脂肪的染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比與其含量的線性回歸方程為：Y=-0.3+1.048X(R2=0.831，r=0.912)；在3個(gè)回歸方程中Y為染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比，X為測定含量。3個(gè)回歸方程R值都很高，說明不同等級火腿腸的主要營養(yǎng)成分的照相測定結(jié)果與化學(xué)測定結(jié)果具有非常好的線性關(guān)系，從而可以確定通過主要營養(yǎng)成分的照相測定結(jié)果預(yù)測化學(xué)測定結(jié)果是精確可靠的。

表2 火腿腸切片中染色淀粉和蛋白質(zhì)所占像素及其占觀察總視野像素的百分比 (放大20倍)?Table 2 Pixels of starch and protein stained in slices of ham sausages and their percentage accounted for the total pixels (magnified 20 times; n=3)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；視野總像素為24 576 000。

表3不同等級火腿腸的主要營養(yǎng)成分含量

Table 3 Mass fraction (dry basis) of main nutrients in different grades of ham sausages (n=3)%

為了驗(yàn)證已建立的上述回歸方程用照相測定染色面積百分比推算出火腿腸中蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪含量的精確性，再次從每個(gè)級別中選取5根火腿腸，分別用化學(xué)方法測出其蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉含量和用照相法測出這3種營養(yǎng)成分的染色面積比。對化學(xué)方法測定出來的蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉含量的平均值和采用照相法測出來的染色面積比推算出平均值之間的差異性進(jìn)行t-檢驗(yàn)，結(jié)果表明差異不顯著性(P>0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，再次證明用照相測定火腿腸中蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉的染色面積百分比能精確地得出出它們的含量。

2.2.2 顯微照片直接推斷火腿腸的級別 由圖1發(fā)現(xiàn)普通級火腿腸的脂肪顆粒大且分布不均勻，優(yōu)級火腿腸的脂肪顆粒大小分布較為均勻，特優(yōu)級火腿腸的脂肪顆粒小分布均勻。由圖2發(fā)現(xiàn)普通級火腿腸的淀粉顆粒大小不均勻且蛋白質(zhì)含量較少，優(yōu)級火腿腸和特優(yōu)級火腿腸的淀粉顆粒分布均勻且蛋白質(zhì)含量較高。通過比較3種不同火腿腸的形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)火腿腸的脂肪、淀粉顆粒及網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)有明顯的差異，因此，它們可以作為不同級別的輔助判定標(biāo)準(zhǔn)使用。

2.2.3 照相測定染色面積百分比法預(yù)測感官評分 GB/T 20712—2006標(biāo)準(zhǔn)對火腿的組織狀態(tài)只進(jìn)行了文字描述，在實(shí)際日常管理的操作過程中具有一定的難度。首先，要得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果，需要大量品嘗評分人員的參與(一般要求≥50人)，不僅成本大，而且操作難度大且人為誤差較大。特別是文字描述不利于定量分析，執(zhí)行起來也較為困難。因此，本研究對火腿腸的結(jié)構(gòu)采用愉悅評分的方法進(jìn)行賦值，以利于定量分析，其中火腿腸等級和淀粉含量呈負(fù)相關(guān)，與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，與脂肪含量沒有相關(guān)性。

通過感官評定得出特優(yōu)級、優(yōu)級和普通級這3種火腿腸結(jié)構(gòu)品質(zhì)的感官評價(jià)結(jié)果，具體的感官評分如下：特優(yōu)級3.90±0.12，優(yōu)級3.66±0.11和普通級2.00±0.13。單因素方差分析(F-檢驗(yàn))結(jié)果表明每個(gè)級別的所有評分結(jié)果(20×10=200)之間的差異沒有顯著性(P>0.05)；但是3種不同等級火腿腸結(jié)構(gòu)的感官評定結(jié)果之間差異顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

然后通過顯微照相技術(shù)得到的蛋白質(zhì)、淀粉染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比與火腿腸結(jié)構(gòu)的感官分析所得的評分值建立回歸模型，從而得到采用蛋白質(zhì)、淀粉染面積所占像素占觀察視野總像素的百分比預(yù)測火腿腸結(jié)構(gòu)的感官評分的回歸方程：

Y=7.827+0.054X1-0.125X2(R2=0.917，r=0.957)，

(1)

式中：

Y——火腿腸的結(jié)構(gòu)感官評分；

X1——蛋白質(zhì)染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比，%；

X2——淀粉染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比，%。

根據(jù)R2=0.917判斷該模型的擬合效果非常好。

為了測試或驗(yàn)證該回歸方程預(yù)測火腿腸的結(jié)構(gòu)感官評分的精確性，由30名品嘗評分人員對半根火腿腸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行感官評價(jià)得到實(shí)際評分值；而對同一根火腿腸的另一半進(jìn)行顯微照相分析得出蛋白質(zhì)、淀粉的染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比，并采用回歸方程預(yù)測得到火腿腸的結(jié)構(gòu)感官評分預(yù)測值。通過t檢驗(yàn)表明實(shí)際評分值與預(yù)測評分值之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.2.4 運(yùn)用顯微照相分析結(jié)果聚類判定火腿腸的級別

采用火腿腸結(jié)構(gòu)感官評分的回歸方程預(yù)測值、蛋白質(zhì)染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比和淀粉染色面積所占像素占觀察視野總像素的百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析的結(jié)果如圖3所示。圖3表明，3個(gè)不同級別的火腿腸的相關(guān)數(shù)據(jù)很明顯地分布在3個(gè)不同的區(qū)域，可以很好地區(qū)分特優(yōu)級、優(yōu)級和普通級的火腿腸樣品。因此，這種方法可以估計(jì)火腿腸的質(zhì)量并對其進(jìn)行分類。

圖3 火腿腸中染色淀粉和蛋白質(zhì)所占像素占觀察視野總像素的百分比及感官評分聚類圖

Figure 3 Cluster diagrams of pixel percentage of stained starches and proteins accounted for the total pixels in ham sausages

3 結(jié)論

采用顯微照相技術(shù)測定蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉的染色面積所占像素戰(zhàn)占觀察視野總像素的百分比能精確地測定其在火腿腸中的含量；觀察火腿腸的切片照相圖可作為判斷其級別的輔助手段；運(yùn)用顯微照相技術(shù)測得的蛋白質(zhì)和淀粉的染色面積百分比能精確地預(yù)測火腿腸的結(jié)構(gòu)感官愉悅評分；用顯微照相技術(shù)測得的蛋白質(zhì)和淀粉的染色面積百分比以及這2組數(shù)據(jù)預(yù)測得到的結(jié)構(gòu)感官愉悅評分能有效地判定出火腿腸的級別。所以，顯微照相技術(shù)能應(yīng)用于火腿腸的品質(zhì)評價(jià)。此外，具有應(yīng)用于午餐肉、熱狗香腸等食品以及可切片處理的可食新鮮植物組織的分析檢測的潛力。

本研究所得出的蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉纖維照相測定方法比傳統(tǒng)的化學(xué)測定方法速度快，但是仍然需要在縮短染色時(shí)間方面做進(jìn)一步的研究。此外，目前所用的專業(yè)設(shè)備對操作人員的技術(shù)要求較高，需要進(jìn)一步智能化以簡化人員操作程序；未來還應(yīng)開發(fā)出便攜式的快速照相儀以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速測定的目標(biāo)。