噬菌體防治植物細菌性病害研究進展①

趙曦，鄭德洪

（廣西大學農學院 南寧市 530004）

1 植物病原細菌的概述及其為害

許多植物病原細菌引發(fā)的重要病害，給各國農業(yè)生產造成巨大的經濟損失，盡管許多研究學者不斷研究對抗植物病原細菌的防治辦法，但依然較難防控病原細菌病害。

1.1 丁香假單胞菌

丁香假單胞菌能夠引起菜豆暈疫病、桃樹潰瘍病、十字花科黑斑病、番茄細菌性葉斑病等，現已感染300 多種經濟作物，包括豆科、十字花科、薔薇科、茄科等，是引發(fā)植物病害十大病害之首[1]。

1.2 青枯雷爾氏菌

青枯雷爾氏菌可能是世界上最具破壞性的植物病原細菌。它是一種土壤傳播的病原體，通過植物的傷口、根尖或側根出芽處的裂縫感染植物，造成植物整株萎蔫。由于青枯雷爾氏菌遍布世界許多國家和地區(qū)，它們的地理來源、宿主范圍和致病行為各不相同，在熱帶地區(qū)的許多發(fā)展中國家的農業(yè)中發(fā)病率較高[2]。

1.3 農桿菌

農桿菌是冠癭瘤的病原體，冠癭瘤是世界范圍內影響各種作物的最嚴重的植物病害之一。在自然界中，這種土壤細菌在寄主植物的傷口部位誘導腫瘤生長，嚴重限制了作物的生長能力和產量。

1.4 水稻黃單胞菌

水稻黃單胞菌是一種棒狀革蘭氏陰性細菌。它產生一種黃色的可溶性色素（稱為菌黃素）以及胞外多糖。胞外多糖在保護細菌免受環(huán)境影響以及幫助細菌在風、雨傳播擴散方面具有重要作用。水稻黃單胞菌的傳播途徑包括灌溉用水系統、水花飛濺或風吹雨淋，以及最重要的初級接種源是受侵染的上一季稻茬。水稻黃單胞菌引起的水稻白葉枯病對水稻產量影響非常大，減產達20%～30%嚴重可達50%～60%甚至顆粒無收[2]。

2 植物細菌病害防治手段

國內外研究學者對植物病害的防治進行了大量的研究，目前的防治措施有以下幾類：

2.1 化學藥劑

由于化學藥劑成本較低，人們對其使用不加以限制，出現濫用、過量使用化學藥劑的情況。不同種類的化學藥劑的使用，對環(huán)境和人體都存在負面影響。抗生素的濫用還會導致一些植物病原菌對抗生素的抗性，植物病原菌對抗生素的耐藥性已成為防治病原細菌的嚴重問題[3-5]。常用的抗生素類殺菌劑如農用硫酸鏈霉素、中生菌素等使病原細菌產生較強的抗藥性，防治效果較差且對人體、動物及環(huán)境有較強的毒害作用，國家即將出臺政策將抗生素類化學藥劑列為“處方藥”，不得濫用[6]。

常用的銅基化合物殺菌劑如無機銅化物、堿式硫酸銅（波爾多液）等。自1885 年波爾多液首次用于植物病害防治以來，大量的銅基抗菌化合物被開發(fā)應用于植物保護，銅基化合物對植物病原細菌有較強的毒性，對動物的毒性較低且制作成本低廉。隨著銅基抗菌化合物大量頻繁的使用，許多病原細菌對銅基化合物產生了抗性。銅基化合物大多為堿性，無法與其他農藥混用，可混性差，且重金屬對環(huán)境的污染，引起人們對生態(tài)系統長期可持續(xù)性的擔憂[4]。

2.2 土壤處理

土壤處理法處理一些土傳病害，使用土壤添加劑、土壤暴曬和熏蒸等方法。例如利用塑料薄膜覆蓋地面，膜下灌水淹沒土壤，密封30 d左右，如遇連續(xù)高溫，土壤溫度可達60℃，20 d 即可起到殺蟲殺菌的作用[7]。缺點是操作有一定難度，同時會對土壤中的一些有益微生物造成損害。

2.3 輪作

合理的輪作能夠在一定程度上降低少數植物的病原細菌的為害。如煙草黑脛病、蠶豆根腐病、甜菜褐斑病、西瓜蔓割病和番茄青枯病等均通過土壤侵染。如將感病的寄主作物與非寄主作物實行輪作或水旱作物輪作，便可較大程度地減少這種病菌在土壤中的數量，減輕病害；同時也可減少作物根部的線蟲，使其在土壤中的蟲卵數量減少，達到減輕危害的目的。

2.4 選育抗病品種

抗病品種是利用常規(guī)雜交育種技術結合分子標記輔助選擇技術，快速高效地選育優(yōu)良品種的一種技術手段[8]?？共∑贩N的選育能夠使該品種在一定程度上減少病蟲害的發(fā)生。例如雜交得到感溫型常規(guī)稻品種白絲占，能夠抗白葉枯強病毒菌系Ⅴ型菌兼抗稻瘟病，抗白葉枯病（Ⅳ型菌1 級，Ⅴ型菌3級）[9]。

3 噬菌體

3.1 噬菌體

噬菌體是一種專門殺死細菌的病毒，但對非靶向的細菌和人類無毒[10]。早在100 多年前被發(fā)現，但當時抗生素的崛起，導致科研人員擱置了對噬菌體的研究。由于時代的發(fā)展，人們越來越重視生態(tài)環(huán)境的保護。細菌對抗生素產生耐藥性，以及使用化學品對環(huán)境可能產生的不良影響，使人們重新對開發(fā)替代控制策略來防治植物中的細菌性病害產生了興趣[11]。噬菌體是通過在細菌內感染、復制、傳播。噬菌體在生態(tài)系統中廣泛存在且種類豐富，存在于所有可以發(fā)現細菌的環(huán)境中，在人類和動物身上也有他們的身影，在生態(tài)系統營養(yǎng)循環(huán)、細菌病原體的進化等方面起著非常重要的作用。噬菌體和細菌在進化中勢均力敵，不相上下。盡管我們看不到噬菌體，但它對我們的生活依然起到相當重要的作用。噬菌體作為生物農藥正在被廣泛研究。

3.2 噬菌體的分類

噬菌體根據核酸類型可分為四大類：單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈RNA（ssRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）。由于噬菌體專性寄生于易感染病原細菌，按照噬菌體在宿主細胞體內呈現的生命狀態(tài)可分為4 種：裂解性、溶原性、偽溶原性和慢性感染[12]。根據形態(tài)大體分為頭尾、瓶狀、絲狀、水滴狀、桿狀、球狀等[13]?，F有關于噬菌體的報道大多為裂解性噬菌體，近幾年相繼出現了利用絲狀噬菌體治療的報道[14-15]。

頭尾結構的噬菌體是通過中空的尾部將遺傳物質注射到宿主菌細胞內，一旦進入細胞，噬菌體就會利用宿主菌細胞的代謝機制，在細胞內完成遺傳物質的復制、組裝，最后裂解宿主細胞。宿主細胞被裂解后釋放大量子代噬菌體，子代噬菌體再次侵入相鄰細胞，循環(huán)往復。絲狀噬菌體，由幾千個不等（例如M13由6 407個核苷酸）的核苷酸構成一個環(huán)狀單鏈DNA，呈螺旋陣列排列，再由長絲的管狀衣殼蛋白包裹著[16]。絲狀噬菌體相對溫和，不會溶解宿主細胞，與宿主細胞共生共存。絲狀噬菌體進入細胞后，在細胞內繁殖，再從細胞內源源不斷地分泌出來，噬菌體在細胞內持續(xù)釋放病毒粒子，但噬菌體的合成和釋放都不會破壞細胞或使細胞裂解，細胞處于持續(xù)感染狀態(tài)。例如絲狀噬菌體VGJφ、CTXφ和φRSM1從霍亂弧菌基因組中切除一部分堿基對，但不會殺死宿主細胞[17]。

4 噬菌體防治細菌病害的應用

在許多年前，研究學者已經認識到噬菌體能夠很大程度影響細菌基因組進化[15]。利用基因工程改造噬菌體，能夠直接或間接賦予噬菌體殺菌能力，例如將rpsL和gyrA基因整合到溫和噬菌體中，受感染的病原細菌對鏈霉素敏感[18]。隨著人口增長對糧食產量的巨大需求，噬菌體防治病害的應用與日俱增，噬菌體既可以作為單獨的防治策略，也可以作為綜合防治的一部分。

Kelvin Kimutai Kering 發(fā)現噬菌體混合物可以與低濃度的CuSO4一起用于殺死更多的植物病原菌[19]。Flaherty 等人利用突變噬菌體對天竺葵白葉枯病進行防治，每日噴灑突變噬菌體混合液于濕潤天竺葵葉片表面，與對照組（未噴灑噬菌體混合液）相比，每天使用噬菌體混合物降低了70%～85%的發(fā)病率[11]。Obradovic 利用噬菌體合成孔徑雷達誘導劑在6周左右的番茄根部施藥，能夠顯著降低番茄細菌斑病的發(fā)生[20]。Adriaenssens 利用噬菌體?AS1浸泡受感染的馬鈴薯種子塊莖，軟腐病病情明顯減輕，產量增加13%[21]。Das等人利用噬菌體雞尾酒療法提前處理未發(fā)病的葡萄藤，預防通過昆蟲傳播的葡萄皮爾斯病，能夠明顯降低葡萄皮爾斯病的發(fā)病率[22]。Rombouts 利用從韭菜白葉枯病地區(qū)土壤中分離、篩選到噬菌體，提前用噬菌體浸泡韭菜苗再將其種植在含有紫丁香單胞菌的地區(qū)，韭菜白葉枯病的發(fā)病率明顯降低?；蚍N植韭菜后噴灑噬菌體混合液，噴灑噬菌體混合液的韭菜與未噴灑噬菌體的對照組發(fā)病率分別為38.5%和63%。兩種方法都能能夠明顯抑制韭菜白葉枯病的發(fā)病[23]。Wei利用噬菌體雞尾酒療法防治馬鈴薯青枯病，將6種噬菌體混合液注入植株能使80%的馬鈴薯免受青枯病困擾，噴灑混合液一周后能夠殺滅土壤中98%的青枯菌[24]。Muturi利用噬菌體抑制果膠桿菌引起的肯尼亞馬鈴薯軟腐病，在馬鈴薯切片上接種細菌前后1 h，涂抹噬菌體，可使軟腐病減輕90%以上[25]。Denyes 等人利用噬菌體具有特異性的特點對大量食源性細菌進行穩(wěn)健和特異性診斷，不僅可以降低食源性疾病的發(fā)病率，還可以降低傳統病原體檢測的昂貴費用[26]。越來越多的研究學者利用噬菌體防治病原細菌，噬菌體作為農業(yè)生產防治有很大的發(fā)展前景。

5 噬菌體的優(yōu)勢

5.1 噬菌體在環(huán)境中的優(yōu)勢

噬菌體是包括根系在內的生態(tài)系統中最豐富的生物之一，在細菌的進化過程中起到了至關重要的作用。而且噬菌體對環(huán)境沒有毒性，不會造成環(huán)境污染。1921年Bruynoghe等最先使用噬菌體制劑治療皮膚葡萄球菌化膿性感染，病情在2 d內有所好轉，身體其他部位未受影響[27]。

由于噬菌體有很強的生物特異性，只感染宿主細菌，對非靶向細胞沒有識別能力，對環(huán)境中的其他菌群不產生影響，不會破壞土壤微生物的多樣性，可滿足當代提倡的綠色無公害農業(yè)要求。

5.2 噬菌體在基因組學方面的優(yōu)勢

盡管噬菌體的基因組相對較小，但是對宿主細胞的影響卻很大[16]。由于噬菌體基因組堿基或堿基對數量少，使得噬菌體的基因組測序、分子克隆和基因組學研究都相對容易[28]。噬菌體基因組較小，但是依舊能夠從已被大家熟知的噬菌體中揭示新的信息，說明與它們的小體積相比，它們對病原菌的行為和進化都有重要影響[16]。噬菌體也會根據病原菌的突變產生適當的變異，傳統細菌病害防治手段則不具備這種優(yōu)勢。

5.3 噬菌體在實際應用中的優(yōu)勢

噬菌體由于基因組序列較小，研制開發(fā)所需的時間短、成本低，僅需將噬菌體與宿主菌細胞共培養(yǎng)，通過離心就可以去除細菌碎片獲得噬菌體粗提物。例如Wei從不同地區(qū)含有青枯病的土壤中分離到的噬菌體，通過噬菌體與高濃度的宿主菌細胞共培養(yǎng)一段時間后離心得到的噬菌體用于實驗[24]。得到的噬菌體易于保存，在4℃條件下可以儲存幾個月沒有明顯的消亡。

6 噬菌體在實際應用中面臨的問題

噬菌體無法自我復制，需要在宿主細胞內復制繁殖，如果沒有宿主細胞，噬菌體無法在環(huán)境中長期存活，會在較短時間內凋亡。一般噬菌體對植物病原細菌的防治是將噬菌體施用于植物根際，由于噬菌體的結構不太穩(wěn)定，在環(huán)境中長期儲存有一定困難，會受到土壤中其他微生物、土壤的pH、紫外線等因素影響。

由于細菌和噬菌體之間無休止的爭奪，細菌已經進化出噬菌體抗性，例如毒素—抗毒素系統、CRISPR CAS免疫系統，會使噬菌體無法進入病原細菌或一旦進入，病原細菌啟動自殺系統，防止噬菌體在細菌內復制合成[29]。宿主細胞對噬菌體也可以產生抗性突變，宿主菌細胞的受體對于噬菌體侵染細菌起著至關重要的作用。如果宿主菌細胞突變與噬菌體結合的受體，使噬菌體受體不可接近宿主細菌或與宿主細菌受體結合蛋白不互補，噬菌體就失去了有效感染宿主的能力。受體結構的改變以及噬菌體受體的喪失也可能導致吸附受阻[30]。

化學物質對噬菌體的影響研究至今還相對較少，但是表面活性劑和天然有機物會影響噬菌體的存活，其中表面活性劑破壞性較強[31]。

施用噬菌體24 h 后，其存活率明顯降低。頻繁施用噬菌體是目前提高防治效果最有效的方法。但在日常應用上，經濟條件是主要問題，需要評估和尋找延長作物中的噬菌體壽命的化合物平衡環(huán)境與條件。

7 如何提高噬菌體對細菌病害的防治效果

由于噬菌體結構的特點，不易在環(huán)境中長期存活，但在溶液中具有一定的穩(wěn)定性[32]，考慮到噬菌體的蛋白質結構，可以添加賦形劑或者將噬菌體溶液轉化成粉末制劑作為提高噬菌體穩(wěn)定的手段[19]。針對噬菌體對溫度、pH、紫外線等環(huán)境因素的敏感性，可調整施用時間，如夜間或清晨使用噬菌體制劑，延長噬菌體存活時間，以盡可能多的感染病原細菌。此外，噬菌體可以通過基因改造，降低病原細菌對噬菌體產生抗性的可能[33]?？梢岳檬删w依附在無毒性的病原細菌內投入環(huán)境中進行生物防治。

8 展望

隨著社會的發(fā)展，人們越來越重視抗生素等傳統防治手段對環(huán)境的破壞，為實現自然生態(tài)協調可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好型社會，各界研究學者努力尋找新型生物防治辦法抵御病原細菌。噬菌體有價格低廉、數量龐大、易于生產、保存便利等特點，已然成為極其重要的生物防治手段之一。噬菌體作為生態(tài)系統中存在范圍最廣，數量、種類都非常繁多的生物，對特定病原細菌的特異性極強，且對環(huán)境、人體及其他細菌沒有毒害作用，有利于環(huán)境保護。在噬菌體與細菌爭奪戰(zhàn)中，噬菌體一直占據著有利條件。相比化學藥劑在很大程度上降低了病原細菌抗性的產生。噬菌體作為植物病害生物防治還處于研究階段，研究學者可以通過各種途徑對噬菌體進行探索和研究，未來利用噬菌體作為植物病害的生物防治手段有良好的發(fā)展前景。