促進(jìn)肌腱-骨界面愈合技術(shù)研究進(jìn)展

韓澤宇 郝躍峰 錢胤華 周靜 邵志強

肌腱-骨界面是軟組織向骨轉(zhuǎn)化的特殊移行區(qū)域，由肌腱、未鈣化纖維軟骨、鈣化纖維軟骨和骨組成[1]。治療肌腱或韌帶損傷的主要手術(shù)方式是將其縫合至骨面或骨髓道，修復(fù)后肌腱-骨界面復(fù)合結(jié)構(gòu)能否恢復(fù)正常將影響其關(guān)節(jié)運動學(xué)和動力學(xué)的恢復(fù)。而肌腱、韌帶損傷修復(fù)術(shù)后，患者常出現(xiàn)瘢痕愈合[2]，導(dǎo)致治療效果欠佳[3-4]。目前，越來越多的研究致力于促進(jìn)肌腱-骨界面修復(fù)和再生的探索，以求恢復(fù)正常的肌腱-骨界面復(fù)合結(jié)構(gòu)。促進(jìn)肌腱-骨界面愈合的技術(shù)較多，主要涉及生長因子和富血小板血漿(PRP)的應(yīng)用，以及細(xì)胞學(xué)及材料學(xué)等方面，本文對這些技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 生長因子

應(yīng)用于促肌腱-骨界面愈合的生長因子主要有轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等[5-6]。

TGF-β具有抑制和刺激細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)作用，其有3種亞型[7]。Wang等[8]采用自體移植兔前交叉韌帶重建模型進(jìn)行實驗研究，結(jié)果顯示TGF-β可促進(jìn)肌腱-骨愈合。Kim等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β不利于肌腱-骨界面的愈合，表現(xiàn)為機械性能下降。其中，抑制TGF-β1可導(dǎo)致瘢痕組織形成，抑制TGF-β3則使愈合過程無明顯改善。雖然通過控制TGF-β亞型可促進(jìn)肌腱-骨界面的再生愈合，但尚未達(dá)到恢復(fù)正常復(fù)合結(jié)構(gòu)的程度。

BMP是TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的一員，其通過結(jié)合到間充質(zhì)細(xì)胞的TGF跨膜細(xì)胞表面受體來激活BMP信號級聯(lián)效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞分化和組織形成[10]。Lee等[11]研究發(fā)現(xiàn)，將膠原凝膠負(fù)載重組人BMP-2注射到肌腱-骨交界處，可促進(jìn)新骨形成，并提高其生物力學(xué)強度，從而促進(jìn)肌腱-骨界面的愈合。Schwarting等[12]在體外動物模型實驗中進(jìn)一步探索BMP-2在肌腱-骨界面整合中的生物學(xué)作用。他們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用BMP-2可觸發(fā)成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和界面區(qū)轉(zhuǎn)分化過程的啟動，上調(diào)界面區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)的形成和BMP受體表達(dá)，下調(diào)BMP-2拮抗劑Noggin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肌腱-骨界面的愈合。然而，應(yīng)用BMP-2的有效性和安全性還需進(jìn)一步研究。

VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，其可促進(jìn)血管生成，增加毛細(xì)血管通透性，并有助于術(shù)后早期肌腱和骨之間的纖維整合[13-14]。Setiawati等[14]采用兔半腱肌肌腱重建前交叉韌帶，然后在骨隧道內(nèi)注射VEGF，并以纖維蛋白膠封蓋隧道。術(shù)后6周發(fā)現(xiàn)，骨隧道內(nèi)Ⅲ型膠原纖維密度增高，相應(yīng)的肌腱-骨界面和隧道直徑逐漸減小，生物力學(xué)分析顯示肌腱移植隧道的極限抗拉強度增大。他們認(rèn)為，VEGF可促進(jìn)肌腱-骨界面的愈合。

FGF家族可調(diào)節(jié)機體的發(fā)育過程、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和代謝活動，其具有促有絲分裂和細(xì)胞保護功能，并有血管生成潛力[15]。Lu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，酸性FGF對包括成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在內(nèi)的中胚層來源細(xì)胞具有明顯的促有絲分裂作用，并可刺激新生毛細(xì)血管形成，從而對肌腱-骨界面的修復(fù)起到積極作用。Yonemitsu等[17]對慢性肩袖撕裂大鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)堿性FGF通過刺激修復(fù)中的張力愈合反應(yīng)來提高肌腱-骨界面的生物力學(xué)強度。

研究已證實，G-CSF在適當(dāng)環(huán)境中可促進(jìn)血管生成，進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)[18]。Ross等[6]采用大鼠岡上肌肌腱離斷修復(fù)模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，注射G-CSF后岡上肌肌腱與肱骨頭之間細(xì)胞募集明顯增加，不過肌腱修復(fù)后的力學(xué)性能恢復(fù)仍較慢。

2 細(xì)胞學(xué)技術(shù)

近年來，細(xì)胞學(xué)技術(shù)促進(jìn)肌腱-骨界面愈合的研究受到廣泛關(guān)注。在這些研究中細(xì)胞學(xué)技術(shù)常與其他技術(shù)聯(lián)用，采用的細(xì)胞包括干細(xì)胞和非干細(xì)胞，主要有間充質(zhì)干細(xì)胞和來源于前交叉韌帶的血管CD34+干細(xì)胞，同種異體真皮成纖維細(xì)胞和人肩峰下囊細(xì)胞。

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)、肌腱間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌大量生長因子、細(xì)胞因子和囊泡對肌腱-骨界面的愈合起積極作用[19]。

研究表明，BMSC在軟組織修復(fù)動物模型中具有抗炎，促肌腱和韌帶修復(fù)的作用[20]。Lu等[21]的研究認(rèn)為，取自新鮮自體骨髓的BMSC和同種異體BMSC均有促肌腱-骨界面愈合的作用。目前，BMSC多來源于骨髓抽吸物，但存在有效濃度較低，數(shù)量和分化能力隨年齡下降等不足，限制了其應(yīng)用。

人脂肪組織含量豐富，易獲取，且數(shù)量恒定，因而ADSC的獲取較容易。ADSC通過旁分泌作用和促分化作用對肌腱-骨界面愈合產(chǎn)生積極影響。然而，對于ADSC治療肩袖撕裂的療效仍存在爭議。Kim等[22]的研究顯示，關(guān)節(jié)鏡修復(fù)術(shù)后注射負(fù)載ADSC的纖維蛋白膠可降低肩袖再撕裂率，但在遠(yuǎn)期療效研究中并未顯示優(yōu)勢。Lipner等[23]研究發(fā)現(xiàn)，對已修復(fù)的肌腱-骨界面進(jìn)行額外的ADSC植入，在生物力學(xué)、骨形態(tài)或組織學(xué)結(jié)果上并無有利影響。綜上所述，ADSC對肌腱-骨界面愈合的作用仍需進(jìn)一步研究。

研究表明，將肌腱間充質(zhì)干細(xì)胞用于肌腱-骨愈合治療中，肌腱-骨整合更好，關(guān)節(jié)內(nèi)移植物完整性較高，細(xì)胞密度和血管密度較低，細(xì)胞排列較好，膠原雙折射性較高，極限載荷更高，其具有明顯促進(jìn)前交叉韌帶損傷早期愈合的作用[24]。

干細(xì)胞促進(jìn)肌腱移植物骨整合的研究多采用自體間充質(zhì)干細(xì)胞，多數(shù)研究療效明顯。然而應(yīng)用自體間充質(zhì)干細(xì)胞存在一些不足，如骨髓抽吸為高度侵入性操作，需進(jìn)行細(xì)胞提取和再提取細(xì)胞應(yīng)用的二次手術(shù)操作。

人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSC)具有免疫原性低，再生能力強，非侵入性收集等優(yōu)點。Jang等[25]采用hUCB-MSC處理骨隧道，術(shù)后肌腱-骨界面處可見具有成熟軟骨細(xì)胞的高級纖維軟骨愈合，骨隧道明顯變小。

2.2 非間充質(zhì)干細(xì)胞

研究發(fā)現(xiàn)，損傷的前交叉韌帶殘留細(xì)胞中存在CD34+干細(xì)胞，隨時間推移，這些細(xì)胞可從造血細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)干細(xì)胞表型[26-27]。Inokuchi等[27]的研究證實，CD34+干細(xì)胞具有成骨和成血管特性，與前交叉韌帶損傷的老年患者相比，自年輕患者中提取的CD34+干細(xì)胞對于前交叉韌帶重建后的肌腱-骨界面愈合更有幫助。但是，目前該方面研究較少，對其促進(jìn)肌腱-骨界面再生或愈合方面的作用還需開展更多研究。

2.3 非干細(xì)胞療法

同種異體真皮成纖維細(xì)胞因與肌腱細(xì)胞都來自中胚層，具有相似形態(tài)，并產(chǎn)生相同的細(xì)胞外基質(zhì)成分[28]，且容易獲取，研究者們開始將其作為新的替代方案。Kwon等[29]的研究表明，在肌腱-骨界面處注射含纖維蛋白的同種異體真皮成纖維細(xì)胞，其負(fù)載極限值較高，組織學(xué)檢查顯示膠原纖維連續(xù)性更高。

有學(xué)者提出，肩峰下囊在肩袖撕裂時的伸展是一種修復(fù)反應(yīng)，而不是退行性改變，這可能表明肩峰下囊組織在肩袖關(guān)節(jié)疾病中具有生物學(xué)活性。有研究表明，來自人肩峰下囊細(xì)胞的體外特性顯示，其表面抗原表達(dá)與BMSC相似，具有類似間充質(zhì)干細(xì)胞的所有特征，包括具有增殖和軟骨分化、成骨分化、成脂分化的潛力[30]。Morikawa等[31]為尋求可最大限度獲取肩峰下囊源性有核細(xì)胞的非酶解方法采取以下4種不同方法處理肩峰下囊樣本：剪刀機械消化法、膠原酶消化法、組織勻漿機機械消化法、最少操作全組織消化法。研究發(fā)現(xiàn)，使用機械法分離肩峰下囊源性細(xì)胞可獲得與膠原酶法相似的有核細(xì)胞數(shù)量。他們建議，在肩袖修復(fù)后可將肩峰下囊放入修復(fù)部位，并置于頂部。

3 生物材料學(xué)技術(shù)

生物材料促進(jìn)肌腱-骨愈合的關(guān)鍵在于可加強細(xì)胞與材料之間的相互作用，表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞黏附、基質(zhì)生成、細(xì)胞增殖分化。目前，應(yīng)用于肌腱-骨界面的生物材料主要有天然聚合物[32-33]、合成聚合物[34]、脫細(xì)胞支架[35]。依據(jù)生產(chǎn)工藝不同，材料的表現(xiàn)形式有薄膜、水凝膠、海綿或泡沫多孔支架、網(wǎng)狀物、微米或納米纖維[36]。

3.1 天然聚合物

天然聚合物具有高生物相容性、高生物活性、高生物降解性等優(yōu)點。Cai等[32]分別采用隨機支架和雙層隨機排列絲素蛋白納米支架來促進(jìn)跟腱損傷的愈合。他們發(fā)現(xiàn)，采用不同支架組的骨隧道面積均明顯減小，移植骨界面BMP-2和骨橋蛋白表達(dá)水平均升高。與隨機支架組相比，雙層隨機排列絲素蛋白納米支架組的肌腱-骨界面異色質(zhì)面積明顯增加，界面寬度明顯減小，膠原成熟程度和組織化程度明顯提高，Ⅰ型膠原表達(dá)水平明顯增高，在極限負(fù)荷和剛韌度方面表現(xiàn)更好。Qian等[33]研究發(fā)現(xiàn)，與排列支架相比，隨機支架或隨機膠原支架結(jié)合針織絲素蛋白在細(xì)胞黏附和成骨誘導(dǎo)方面具有更好效果，提示將其用于肌腱-骨界面愈合的效果更好。但天然聚合物也存在不足，如絲素蛋白需要預(yù)先處理以避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)[37]，膠原的拉伸強度和彈性應(yīng)變均較低[38]。

3.2 合成聚合物

合成聚合物可補充天然聚合物材料的不足，具有高彈性和高孔隙率，可依據(jù)需要調(diào)整成品的形狀和大小，可對材料進(jìn)行功能優(yōu)化等優(yōu)點。Guo等[34]采用電子束蒸發(fā)技術(shù)在聚乳酸-羥基乙酸共聚物膜表面涂覆一種新型生物活性磷酸鈣硅酸鹽陶瓷，制備化學(xué)成分類似于肌腱-骨界面的可裁剪復(fù)合膜，他們發(fā)現(xiàn)改變性能后的樣品更利于細(xì)胞附著和增殖，且顯示出更好的成骨活性。

3.3 脫細(xì)胞支架

脫細(xì)胞支架兼具免疫原性低，生物降解性和生物相容性高，機械性能與天然組織相似，含有豐富的內(nèi)源性整合素結(jié)合位點等優(yōu)勢。Chen等[35]將天然纖維軟骨組織切片制成書本狀，以提高細(xì)胞載量和浸潤能力，并對其進(jìn)行脫細(xì)胞處理。進(jìn)一步的體外研究表明，這種支架無細(xì)胞毒性，且免疫原性低，允許ADSC附著和增殖，具有良好的軟骨誘導(dǎo)活性，并能刺激膠原或糖胺聚糖分泌。同時體內(nèi)研究顯示，單獨使用這種支架可誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞再生纖維軟骨，表現(xiàn)為纖維軟骨在細(xì)胞外基質(zhì)沉積和良好的界面整合。

4 PRP技術(shù)

PRP是一種血小板含量較高的自體血漿制劑，一旦被激活，就會成為含有豐富生長因子的凝膠狀支架，它們因子包括血小板衍生生長因子、TGF-β、VEGF、胰島素樣生長因子，它們均參與肌腱-骨界面的愈合中[39]。大量研究顯示，PRP與生物材料聯(lián)合應(yīng)用具有良好效果。Zhou等[40]將PRP與化合物Kartogenin結(jié)合，通過在大鼠肌腱-骨隧道注射不同物質(zhì)進(jìn)行實驗研究。他們從研究結(jié)果推測，PRP促進(jìn)肌腱-骨隧道界面整合可能因其能促進(jìn)細(xì)胞增殖，而單獨應(yīng)用PRP并不能促進(jìn)纖維軟骨區(qū)形成。據(jù)此他們提出，為了提高PRP在肌腱-骨界面愈合臨床治療中的療效，PRP應(yīng)與“生物化合物”聯(lián)合使用。Zheng等[39]將PRP與中藥淫羊藿結(jié)合，并將其植入兔髕骨橫行截骨斷端之間，結(jié)果顯示，髕骨-髕腱界面出現(xiàn)新生骨擴大和重塑，膠原纖維結(jié)構(gòu)良好，再生纖維軟骨中的蛋白多糖生成旺盛。

5 結(jié)語

技術(shù)的不斷改進(jìn)和材料的革新給臨床治療肌腱損傷帶來新啟示，雖然很多研究結(jié)果顯示這些新技術(shù)對肌腱-骨界面愈合有積極作用，但是與恢復(fù)正常的肌腱-骨界面復(fù)合組織結(jié)構(gòu)的目標(biāo)仍相距甚遠(yuǎn)，大部分研究處于動物實驗階段，尚未轉(zhuǎn)化成臨床應(yīng)用，未來還需開展更多相關(guān)研究。