活體共聚焦顯微鏡在微生物性角膜炎診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

呂 健，曾思明，蔣 莉，李蘭建，徐 帆

0引言

微生物性角膜炎(microbial keratitis,MK)是全球引起角膜盲的主要眼病之一[1-2]。在發(fā)展中國(guó)家因MK導(dǎo)致的單眼失明高達(dá)(150～200)萬(wàn)人/a，預(yù)防視力永久性喪失的關(guān)鍵在于早期準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷從而實(shí)現(xiàn)早期精準(zhǔn)治療。角膜刮片微生物培養(yǎng)是目前診斷MK病因的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在取材帶來(lái)醫(yī)源性損傷、病原體培養(yǎng)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)的陽(yáng)性率低等許多缺點(diǎn)[3-4]?；铙w共聚焦顯微鏡(invivoconfocal microscopy,IVCM)作為一種非侵入性成像技術(shù)[5-8]，可實(shí)時(shí)提供清晰的角膜各層圖像，對(duì)角膜疾病診斷和隨訪起到不可替代的作用[9]。但由于儀器在檢查會(huì)產(chǎn)生大量的圖片，使醫(yī)生診斷負(fù)擔(dān)加重，診斷準(zhǔn)確性下降。近年來(lái)，人工智能(artificia intelligence，AI)已被廣泛應(yīng)用于輔助醫(yī)生通過共聚焦圖片診斷角膜炎，并表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性[10-11]。

1活體共聚焦顯微鏡在MK診斷中的應(yīng)用

1.1真菌性角膜炎迄今為止，在全球已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大于70種可引起角膜感染的真菌[12]。在以工農(nóng)業(yè)為主而醫(yī)療條件有限的發(fā)展中國(guó)家中，真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是導(dǎo)致國(guó)民單眼失明的主要原因[13]。早期識(shí)別真菌病原體并提供有針對(duì)性的治療可以降低嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率。通過IVCM圖像可直觀地觀察菌絲、孢子，以及菌絲在角膜基質(zhì)內(nèi)的生長(zhǎng)方式，是診斷FK的重要手段[14]。

IVCM中菌絲通常表現(xiàn)為高反光的紊亂線形結(jié)構(gòu)，曲霉和鐮刀菌長(zhǎng)度約在200～400μm，但菌種的不同其分支或分節(jié)也不同，如：曲霉菌絲直徑5～10μm，呈45°分枝成兩段；而鐮刀菌則多以90°分枝。酵母如白色念珠菌表現(xiàn)為卵形芽殖體，長(zhǎng)10～40μm，寬5～10μm，并有可能發(fā)展成假菌絲[15-16]。Das等[17]研究結(jié)果表明，IVCM在早期診斷深部FK的敏感性為83%。Kanavi等[18]對(duì)133例感染性角膜炎的病例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IVCM的敏感性為94%，但通過涂片和培養(yǎng)檢查，真菌性角膜炎的檢出率僅分別為20.3%和12.0%。Winchester等[19]觀察了FK治療過程中角膜的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過嚴(yán)格治療4d后，這些細(xì)長(zhǎng)的纖維減少并轉(zhuǎn)變?yōu)槎痰陌咨w維，繼續(xù)治療3wk后菌絲變?yōu)橹睆?～10μm類似于反應(yīng)細(xì)胞的高反光的圓形腫塊，最終高反光的圓形結(jié)構(gòu)完全消失。有研究使用IVCM對(duì)121例真菌性角膜炎患者抗真菌治療過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隨著病情的好轉(zhuǎn)，IVCM可以觀察到患者菌絲密度和炎性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，角膜基質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)良好[20]。

綜上所述，醫(yī)生可以通過IVCM可視化菌絲和類菌絲結(jié)構(gòu)從而做出診斷，對(duì)治療期間角膜組織的損傷與修復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)地觀察，對(duì)評(píng)估FK的治療效果和選擇手術(shù)時(shí)機(jī)有重要的指導(dǎo)意義[18-21]。IVCM還可用于深部角膜真菌感染的檢測(cè)，是FK的重要診斷工具。盡管IVCM具有許多優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一些限制，例如需要熟練的操作員或經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生，檢查時(shí)需要患者的配合，角膜瘢痕會(huì)嚴(yán)重干擾檢查結(jié)果。

1.2棘阿米巴角膜炎棘阿米巴角膜炎(acanthamoeba keratitis，AK)是一種因棘阿米巴原蟲感染導(dǎo)致的具有潛在破壞性的角膜潰瘍。常表現(xiàn)為單眼發(fā)病，伴異物感、畏光、流淚，以及與體征不符的劇烈疼痛，未及時(shí)治療常并發(fā)角膜穿孔。避免引起嚴(yán)重的并發(fā)癥關(guān)鍵在于早期準(zhǔn)確診斷及治療[22-23]。但棘阿米巴角膜炎早期的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易延誤治療[24]。微生物培養(yǎng)作為診斷AK的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、陽(yáng)性率低(0～68%)的缺點(diǎn)[25-26]。

IVCM在棘阿米巴病原體表現(xiàn)為休眠期的包囊和活動(dòng)期的滋養(yǎng)體兩種形態(tài)[16]。在1994年有文章首次報(bào)道了通過使用IVCM觀察到AK時(shí)出現(xiàn)放射性角膜神經(jīng)炎以及疾病后期基質(zhì)內(nèi)形成空腔，揭開了共聚焦成像技術(shù)可以應(yīng)用于AK診斷的面紗[27]。后期大量的文獻(xiàn)指出棘阿米巴包囊常出現(xiàn)在角膜上皮層及基質(zhì)層，其表現(xiàn)為直徑15～28μm，球形、圓形、卵球形、梨形或呈雙壁狀超反射結(jié)構(gòu)[28-32]。滋養(yǎng)體在IVCM圖像中表現(xiàn)為大小15～100μm、形態(tài)不規(guī)則的高反光結(jié)構(gòu)[33]。Chew等[27]認(rèn)為滋養(yǎng)體大小為15～100μm且周圍被低反射的基質(zhì)包圍的高反射結(jié)構(gòu)。也有學(xué)者將滋養(yǎng)體描述呈線狀結(jié)構(gòu)[33]。自2004年以來(lái)，很多研究強(qiáng)調(diào)了IVCM作為AK有效診斷工具的作用[33-35]。在Kanavi等對(duì)133例感染性角膜炎研究的文章中，指出IVCM在診斷AK的敏感性為100%和特異性為84%[28-36]。因該項(xiàng)研究的對(duì)照組是利用角膜刮片進(jìn)行病原學(xué)培養(yǎng)，其結(jié)果會(huì)受深層感染的樣本數(shù)量的影響，可信度有待考量。Tu等[36]使用IVCM對(duì)125例懷疑患有AK的患者進(jìn)行檢查，其診斷檢測(cè)靈敏度范圍為90.6%～92.9%，特異性范圍為77.3%～100%，證實(shí)了可以使用IVCM作為AK的診斷工具的結(jié)論。Matsumoto等[37]表明對(duì)AK患者角膜的重復(fù)IVCM檢查結(jié)果顯示，經(jīng)規(guī)范化治療后4～6wk，滋養(yǎng)體和包囊開始消失。Babu等[38]使用IVCM監(jiān)測(cè)聯(lián)合真菌和棘阿米巴角膜炎的治療，獲得了較好的效果。這些研究結(jié)論說明IVCM對(duì)角膜深層的棘阿米巴原蟲具有診斷作用，在評(píng)估疾病的治療效果具有重要潛力，是早期、快速地診斷AK的主要方法。

1.3單純皰疹病毒性角膜炎單純皰疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)在發(fā)達(dá)國(guó)家中是角膜盲的主要傳染性病因[39]。單純皰疹病毒潛伏于神經(jīng)元及上皮中，易引起反復(fù)感染和炎癥，使上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞溶解，最終形成角膜瘢痕[18]。HSK感染時(shí)IVCM下可在翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞層見到活化的樹突細(xì)胞浸潤(rùn)，而恢復(fù)期其密度降低，在深基質(zhì)層瘢痕與正常角膜交界處還可觀察到眾多的微血管小枝，但并未描述病毒的具體形態(tài)。Cavanagh等[40]使用IVCM分析了1例慢性復(fù)發(fā)性皰疹感染的情況，與先前的皰疹病毒受累區(qū)域相比，復(fù)發(fā)后上皮細(xì)胞較正常上皮細(xì)胞變大，角膜基質(zhì)層致密纖維化，并且在瘢痕區(qū)域上皮下神經(jīng)叢缺失。Rosenberg等[41]描述使用IVCM對(duì)16例患單側(cè)HSV的患者進(jìn)行觀察，其中11眼基底神經(jīng)正常，有2眼基底神經(jīng)缺失和3眼長(zhǎng)神經(jīng)纖維束的數(shù)量減少及在瘢痕區(qū)基底上皮細(xì)胞中高度反射的樹突狀結(jié)構(gòu)，并被認(rèn)為是活化樹突細(xì)胞。因此他們提出假設(shè)：圖像中見到朗格漢斯細(xì)胞可能對(duì)臨床醫(yī)生區(qū)分皰疹性角膜炎和細(xì)菌性角膜炎是有幫助的。2011年Toine等發(fā)現(xiàn)通過將裂隙燈與IVCM聯(lián)合使用，檢測(cè)到在35例患者中的14例共出現(xiàn)17次復(fù)發(fā)[42]，提示了IVCM檢查可以通過結(jié)合細(xì)胞水平的形態(tài)學(xué)評(píng)估和客觀角膜背向散射測(cè)量來(lái)增強(qiáng)炎癥活動(dòng)的早期檢測(cè)。Müller等[43]使用IVCM觀察HSK后角膜瘢痕形成眼及對(duì)側(cè)臨床未受累眼發(fā)現(xiàn)：瘢痕眼以及對(duì)側(cè)眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度、總神經(jīng)長(zhǎng)度顯著低于健康對(duì)照組，推測(cè)單側(cè)HSK后雙側(cè)角膜神經(jīng)受損神經(jīng)肽水平降低、內(nèi)皮細(xì)胞損失?？梢?，目前IVCM受限于像素原因，仍不能對(duì)病毒病原體進(jìn)行直觀觀察[44]。但可以通過IVCM觀察和監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)性HSV患者病情的變化，對(duì)其預(yù)后進(jìn)行判斷，并起到與其他類型角膜炎鑒別診斷的作用。

1.4細(xì)菌性角膜炎細(xì)菌性角膜炎(bacterial keratitis，BK)的流行病學(xué)和微生物學(xué)特征常因地理情況有所差異，在溫帶氣候中細(xì)菌是傳染性角膜炎的致病微生物[45]。目前，診斷病原體常用的診斷方法仍然依靠角膜涂片和微生物培養(yǎng)，然而，陽(yáng)性率僅為40%～60%。原因是細(xì)菌直徑僅為1～2μm，除具有特征性的結(jié)構(gòu)或體積較大外(如諾卡菌屬)IVCM無(wú)法直接可視化病變組織中細(xì)菌病原體[15]。IVCM觀察BK時(shí)發(fā)現(xiàn)角膜翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞層大量有圓球形和高反光的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病灶周圍角膜基質(zhì)細(xì)胞密度變大。發(fā)生潰瘍時(shí)角膜IVCM表現(xiàn)為組織缺損、水腫、厚度增加，白細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞數(shù)目明顯增加，這為輔助診斷及預(yù)后提供重要信息[46-47]。Chew等[27]首次使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)角膜基質(zhì)層內(nèi)注射蠟狀芽孢桿菌的BK的兔模型進(jìn)行共聚焦成像，發(fā)現(xiàn)直徑約10μm的細(xì)菌在前基質(zhì)內(nèi)可表現(xiàn)為圓形的、細(xì)小的超反射結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)容易與纖維細(xì)胞和體積較小、反光明顯的白細(xì)胞區(qū)分。Kaufman等[48]使用IVCM觀察2例隱形眼鏡相關(guān)性金黃色葡萄球菌和草綠色鏈球菌感染的角膜炎患者的角膜，IVCM圖片中可見上皮水平以下1.5～2μm直徑的超反射圓形體，其有可能對(duì)應(yīng)細(xì)菌，并通過其大小與球形超反射結(jié)構(gòu)(淋巴細(xì)胞或粒細(xì)胞)區(qū)分。但這些高反射的圓形結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)碎片大小與形態(tài)相似，因此無(wú)法將其與細(xì)菌區(qū)分。Vaddavalli等[49]對(duì)3例有關(guān)諾卡氏角膜炎進(jìn)行研究表明：諾卡氏菌是一種直徑小于1.5μm的分枝纖維狀細(xì)菌，IVCM圖像中可見高反射、短、薄的分支細(xì)絲，當(dāng)存在其他類型的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)邊緣細(xì)絲變得更加明顯?？梢姡壳叭晕茨芡ㄟ^IVCM區(qū)分細(xì)小的細(xì)菌、炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞的碎片，僅可以觀察特殊類型的細(xì)菌病原體。但在治療期間使用IVCM對(duì)BK患者進(jìn)行觀察，可以起到有效監(jiān)測(cè)BK愈合情況的作用，并能通過炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，判斷角膜的嚴(yán)重程度，為治療提供線索。

2人工智能在自動(dòng)識(shí)別IVCM圖像中的應(yīng)用

AI是計(jì)算機(jī)科學(xué)的一個(gè)分支，是研究、開發(fā)用于模擬、延伸和擴(kuò)展人的智能的理論、方法、技術(shù)及應(yīng)用系統(tǒng)的一門新的技術(shù)科學(xué)，其中圖像識(shí)別與分析是人工智能的一個(gè)重要領(lǐng)域。隨著多學(xué)科融合發(fā)展，圖像分析技術(shù)被逐漸應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域，推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷的深刻改革[50-51]。越來(lái)越多的學(xué)者利用AI對(duì)IVCM圖像解讀從而輔助醫(yī)生診斷角膜炎[10,52-53]。

2003年Saini等[53]根據(jù)角膜炎的病因構(gòu)建的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在進(jìn)行外部驗(yàn)證時(shí)可以將43例角膜潰瘍中的39例正確分類。結(jié)果顯示構(gòu)建的模型對(duì)細(xì)菌和真菌識(shí)別的特異性分別為76.47%和100%，分類的準(zhǔn)確率為90.7%，顯著優(yōu)于臨床醫(yī)師的診斷。2016年劉治團(tuán)隊(duì)更是應(yīng)用局部二元模式(local binary pattern，LBP)和支持向量機(jī)(support vector machne，SVM)模型，將200張IVCM圖像中的菌絲和正常角膜的神經(jīng)纖維區(qū)分，準(zhǔn)確率為93.53%[10]。2018年該團(tuán)隊(duì)利用自適應(yīng)魯棒二進(jìn)制模型(adaptive robust binary pattern，ARBP)結(jié)合SVM的方法構(gòu)建自動(dòng)診斷算法框架，結(jié)果顯示在大約400幅圖像的數(shù)據(jù)集上實(shí)現(xiàn)了菌絲自動(dòng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性為99.74%，靈敏度和特異性更是接近于100%。當(dāng)ARBP結(jié)合SVM融入線段定量分析法后構(gòu)建的具有自動(dòng)識(shí)別菌絲并量化菌絲密度的深度學(xué)習(xí)模型，獲得了靈敏度為89.29%，特異性為95.65%。ROC曲線下面積為0.946的結(jié)果，該方法與角膜刮片結(jié)果相比具有良好的優(yōu)越性[13]。

這些研究說明了AI在輔助醫(yī)生通過IVCM識(shí)別FK，提高準(zhǔn)確性方面具有重要的意義。但是應(yīng)用AI輔助診斷FK的優(yōu)勢(shì)是顯而易見的：圖像自動(dòng)檢測(cè)不依賴技術(shù)人員，并且可以幫助經(jīng)驗(yàn)不足的年輕醫(yī)生，通過提供及時(shí)、準(zhǔn)確、客觀和定量地評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)真菌性角膜炎。但目前這些研究的圖像數(shù)量少，通常來(lái)自一個(gè)醫(yī)療中心，單一的設(shè)備設(shè)置、圖片采集系統(tǒng)和人口特征可能會(huì)影響IVCM圖像的多樣性。

3展望

感染性角膜炎患者角膜變薄且疼痛明顯，IVCM檢查是一種接觸性檢查工具，操作過程易引起患者眼部不適，且IVCM的成像視野小，操作者須將探頭緩慢移動(dòng)至整個(gè)感染區(qū)域，對(duì)于角膜邊緣感染性微生物或間接感染成像困難，因此更需要患者高度的配合才能采集清晰圖像和進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢查。并且對(duì)于同一患者感染期間跟蹤角膜內(nèi)細(xì)胞變化或進(jìn)行隨訪檢查時(shí)，對(duì)相同區(qū)域進(jìn)行成像對(duì)比存在難度。另外，IVCM檢查是產(chǎn)生的大量缺乏結(jié)構(gòu)特異性的圖像，即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生對(duì)結(jié)果的判讀仍存在巨大挑戰(zhàn)。當(dāng)前已有研究使用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法輔助醫(yī)生進(jìn)行診斷，但這些研究的圖像通常來(lái)自一個(gè)醫(yī)療中心，單一的設(shè)備設(shè)置、圖片采集系統(tǒng)和人口特征可能會(huì)影響IVCM圖像的多樣性，因而系統(tǒng)性能也會(huì)受到影響。且人工智能技術(shù)礙于全球醫(yī)療大數(shù)據(jù)的建立未完善以及人工智能處理圖像的過程“黑匣子”特性，使得人工智能算法在圖像層面分析模式和做出決策的方式變得模棱兩可[51,54-55]。

隨著人工智能技術(shù)探究與發(fā)展，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的逐步落地。相信在不久的將來(lái)，隨著共焦顯微鏡成像技術(shù)的提高以及大數(shù)據(jù)平臺(tái)的構(gòu)建、AI算法的優(yōu)化，活體共聚焦顯微鏡能更精確地輔助醫(yī)生提高對(duì)各類角膜疾病的診斷，提供遵循疾病過程和指導(dǎo)治療的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。