非小細胞肺癌耐藥機制及其逆轉(zhuǎn)耐藥的研究進展

郭亞楠 蔣兵 郭紅云 王濤 張永東 蘇海翔，

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省醫(yī)學科學研究院/甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

據(jù)中國腫瘤登記中心2018 年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，肺癌在我國男性腫瘤發(fā)病患者中占首位，在女性中位列第三［1］。按照病理類型，肺癌可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占80%［2］。靶向治療、細胞治療和免疫治療的快速發(fā)展為患者帶來了希望，但目前化療仍然是NSCLC 治療的主要手段。腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性是導(dǎo)致臨床化療失敗的主要原因。因此，對多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）機制的研究仍是當今腫瘤研究領(lǐng)域的一個熱點。肺癌的MDR 機制涉及膜轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的藥物外排泵、酶介導(dǎo)的腫瘤細胞解毒和DNA 修復(fù)功能增強、凋亡調(diào)控基因異常、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子發(fā)揮抗凋亡機制等多種途徑，這些途徑中的關(guān)鍵基因和蛋白都與誘發(fā)腫瘤細胞形成耐藥表型相關(guān)［3，4］。本文就近年來有關(guān)肺癌MDR 的機制研究及中藥在逆轉(zhuǎn)NSCLC 耐藥性方面的研究進展作一簡單綜述。

1 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體蛋白

ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ATP-bingdingcassettetransport，ABC 轉(zhuǎn)運體）蛋白家族是一大類跨膜蛋白，廣泛存在于各種生物體。ABC 轉(zhuǎn)運體利用ATP 水解產(chǎn)生的能量將底物（包括抗癌藥物）從細胞內(nèi)排出，使細胞內(nèi)藥物的濃度降低，在腫瘤細胞表現(xiàn)為耐藥。在ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族中研究較多的是磷酸化糖蛋白（phosphorylated glycoprotein，P-gp）、MDR 相關(guān)蛋白（multidrugresistanceassociated protein，MRP）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等。這些細胞膜藥物轉(zhuǎn)運蛋白均依賴ATP 供能發(fā)揮“藥泵”作用，能把進入細胞內(nèi)的藥物排出細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致藥物細胞毒作用減弱甚至喪失，降低藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，從而導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥［5］。

1.1 P-gp P-gp 由MDR1 基因編碼，是MDR 中發(fā)現(xiàn)最早的耐藥蛋白，屬于ABC 轉(zhuǎn)運體蛋白家族中一員［6］，主要分布在細胞膜上，是一種能量依賴性的跨膜磷酸糖蛋白，在許多MDR 腫瘤細胞株、原發(fā)性和獲得性耐藥的癌癥患者腫瘤組織中都檢測到了P-gp 在細胞膜上的過度表達。耐藥性的產(chǎn)生是由于P-gp 通過其疏水位點和疏水性，與紫杉醇、蒽環(huán)類等抗腫瘤化療藥物結(jié)合，將進入細胞內(nèi)的藥物泵出細胞，表現(xiàn)為耐藥，Pgp 高表達是導(dǎo)致MDR 現(xiàn)象的重要依據(jù)［7，8］。在NSCLC細胞系SW-1573 中通過遞增阿霉素濃度的篩選，獲得了MDRP-gp 的過表達，細胞表現(xiàn)為MDR［9］。Solazzo等［8］研究表明，P-gp 在細胞膜上的過度表達可以使多種藥物從細胞中分離出來。研究也表明，NSCLC 腫瘤組織中的P-gp 過表達［10，11］。因此在NSCLC 多藥耐藥中，P-gp 過度表達是其產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵因素。通過降低MDR1 基因的表達，抑制P-gp 的功能是目前逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的主要方法之一。

1.2 MRP MRP 在ABC 轉(zhuǎn)運體蛋白亞家族蛋白質(zhì)線性序列分類中屬于ABCC。在目前研究中，MRP 共有13 個成員，其中有9 種與腫瘤耐藥相關(guān)，包括MRP1～MRP9，MRP 與P-gp 一樣屬于ATP 結(jié)合盒式跨膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員［12］。在NSCLC 中MRP1 蛋白表達水平比在小細胞肺癌中高，并且還發(fā)現(xiàn)MRP1水平與肺癌細胞對阿霉素、長春新堿、足葉乙甙的敏感性下降有關(guān)，說明MRP1 與肺癌的MDR 有關(guān)［13］。MRP 導(dǎo)致NSCLC 產(chǎn)生耐藥的機制主要有三個方面，一是MRP在NSCLC 細胞中的作用與P-gp 相似，但作用底物與P-gp不同，MRP 主要通過與谷胱甘肽（glutathione，GSH）結(jié)合，將其底物轉(zhuǎn)運出細胞外，使細胞內(nèi)的化療藥物濃度降低；二是MRP 能使抗腫瘤藥物在細胞內(nèi)重新分布，使化療藥物遠離靶點，間接導(dǎo)致耐藥［14］；三是MRP 可以降低細胞內(nèi)的pH 值，在酸性環(huán)境中，藥物被質(zhì)子化后大量外排，導(dǎo)致耐藥［15］。在小細胞肺癌和NSCLC 標本中，發(fā)現(xiàn)87%的NSCLC 腫瘤塊中都可檢測到的MRP，并且MRP 以高表達的形式存在于NSCLC 耐藥細胞中［16］。研究也表明，NSCLC 腫瘤組織中MRP 過表達［17，18］。Wang 等［19］檢測了NSCLC 腫瘤組織中MDR1和凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2 的mRNA 表達情況，發(fā)現(xiàn)63 例NSCLC 的MDR1 mRNA 陽性表達率為81.0%（51/63）。MDR1 同時也是NSCLC 判斷預(yù)后的一個指標，還與凋亡相關(guān)基因的共表達有關(guān)。Gen 等［20］為了探討MRP 基因過表達對NSCLC 患者預(yù)后的影響，檢測了47 例NSCLC 根治術(shù)后石蠟包埋組織中MRP 的表達，發(fā)現(xiàn)MRP mRNA 均過表達，隨訪發(fā)現(xiàn)，其過表達水平與患者的生存時間、化療療效、術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移等有關(guān)，與組織學類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、分化程度、年齡、性別無關(guān)。MRP mRNA 過表達可能作為判斷NSCLC 預(yù)后的一個指標。

1.3 BCRP BCRP 是ABC 轉(zhuǎn)運蛋白超家族的新成員，被確定為抗癌藥的藥物外排泵，最早由Doyle［21］從乳腺癌細胞系MCF-7/AdrVP 克隆出來。BCRP 不僅存在于腫瘤細胞，也分布于正常組織，但組織分布特征不同。BCRP 分子上有1 個ATP 結(jié)合位點及6 個跨膜區(qū)結(jié)合點位，通過外排細胞內(nèi)ATP 依賴的藥物而使細胞產(chǎn)生耐藥性［22］。與BCRP 耐藥機制相關(guān)的化療藥物有蒽環(huán)類、多柔比星、依托泊苷、紫杉醇等。用免疫組化方法檢測72 例確診的NSCLC（ⅢB 和Ⅳ期）腫瘤組織中BCRP 的表達，33 例為陽性［23］。應(yīng)用腫瘤細胞體外培養(yǎng)和藥敏實驗法對60 例未經(jīng)化療的NSCLC 患者行體外化療藥物多柔比星、紫杉醇、順鉑的敏感性檢測，用免疫組織化學方法對BCRP 在NSCLC 中的表達進行檢查，將其表達情況與對應(yīng)的化療耐藥性進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示BCRP 參與介導(dǎo)NSCLC 的MDR［24］。對66 例接受以順鉑為基礎(chǔ)的化療的NSCLC 患者經(jīng)支氣管活檢分析，發(fā)現(xiàn)BCRPmRNA 的表達水平較高［25］。因此，BCRP 是NSCLCMDR 的指標之一。

1.4 肺癌MDR 中P-gp、MRP、BCRP 之間的關(guān)系 MDR中P-gp、MRP、BCRP 之間的關(guān)系三者之間的相同點：P-gp、MRP 及BCRP 均屬于ABC 轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，功能上極其相似，參與MDR 的機制均是依賴ATP的藥物轉(zhuǎn)運泵的作用將化療藥物排出體外，降低細胞內(nèi)藥物濃度從而使細胞表現(xiàn)為耐藥。三者間的不相同點：P-gp、MRP 及BCRP 三者之間的不同點表現(xiàn)在四個方面。一是轉(zhuǎn)運子不同：P-gp、MRP 為全轉(zhuǎn)運子、BCRP 為半轉(zhuǎn)運子，MRP 與P-gp 以全-轉(zhuǎn)運蛋白的形式發(fā)揮作用，可使藥物外排能力明顯提高，降低蒽環(huán)類（柔紅霉素、阿霉素、去甲氧柔紅霉素）、長春新堿、鬼臼霉素類等天然化療藥物在細胞內(nèi)的濃度，從而減弱這些化療藥物的細胞毒性。BCRP 為半-轉(zhuǎn)運蛋白，需與其他轉(zhuǎn)運分子形成二聚體或多聚體活性蛋白復(fù)合體而發(fā)揮作用。二是結(jié)構(gòu)不同：P-gp、MRP 由兩個同源部分組成，每部分含有一個ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個跨膜的疏水區(qū)域，BCRP 的結(jié)構(gòu)中只有一個ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域。三是耐藥譜不同：MRP1 與P-gp 過度表達對蒽環(huán)霉素、阿霉素、長春新堿、紫杉醇以及烷化劑絲裂霉素等都產(chǎn)生耐藥性。但是兩者也有很大區(qū)別。首先，MRP1 對紫杉醇、烷化劑等沒有耐藥性，其次，MRP1 對氨甲蝶呤會產(chǎn)生短期高效的耐藥性，但無長期耐藥性。表明MRP1 能轉(zhuǎn)運氨甲蝶呤，但不能轉(zhuǎn)運其多聚谷酰氨酰化的代謝物［26，27］。BCRP過度表達可導(dǎo)致對藥物敏感的細胞對米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、拓撲替康、SN-38（伊立替康的活性代謝物），但BCRP 過度表達對長春花生物堿、紫杉醇和順鉑藥物不轉(zhuǎn)運。四是耐藥機制不同：MRP 介導(dǎo)的藥物外排需要GSH 的參與，需要MRP 的底物（如足葉乙苷，柔紅霉素和順鉑等），通過MRP/GS-X 泵外排，它不能直接轉(zhuǎn)運其介導(dǎo)耐藥的未經(jīng)修飾的藥物［28］，細胞內(nèi)GSH的水平和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）的活化與MRP 介導(dǎo)的MDR 有關(guān)［29］，P-gp 和BCRP一樣，BCRP 也不需要GSH 協(xié)助轉(zhuǎn)運中性兩極藥物。

2 LRP

肺耐藥蛋白（lung resistance-related protein，LRP）是參與細胞內(nèi)藥物運輸過程的復(fù)雜蛋白，分布于胞質(zhì)及核膜。與P-gp、BCRP、MRP 不同，LRP 不是ABC 轉(zhuǎn)運蛋白，主要位于細胞質(zhì)中，在調(diào)控胞核與胞質(zhì)之間物質(zhì)交換和囊泡運輸中起作用，其能阻止以胞核為靶點的化療藥物（如蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素、長春新堿類、順鉑和卡鉑熔化劑等）通過核孔進入胞核，即使藥物進入胞核發(fā)生藥效前通過胞吐形式把藥物排至胞外［30］，從而降低核內(nèi)藥物濃度，最終導(dǎo)致肺癌對化療藥物耐藥。因此，LRP 基因的過度表達，提示LRP 可通過核靶點屏蔽作用而產(chǎn)生MDR。此外，因LRP 可以介導(dǎo)細胞核和細胞質(zhì)之間的細胞毒性藥物的轉(zhuǎn)運，所以LRP 引起MDR的機制還表現(xiàn)在其可以使具有細胞毒性或抑制性的化療藥物隔離在微囊內(nèi)而不能發(fā)揮作用，使細胞內(nèi)的藥物濃度降低，誘導(dǎo)產(chǎn)生MDR。朱等［31］采用免疫組化方法檢測168 例NSCLC 組織中的LRP 表達結(jié)果顯示LRP 表達的陽性率為64.03%，隨訪部分患者發(fā)現(xiàn)，LRP高表達的NSCLC 患者2 年生存率明顯低于LRP 陰性患者，說明在NSCLC 中LRP 參與了阻止順鉑和紫杉醇等化療藥物對腫瘤細胞DNA 的破壞。檢測腫瘤組織LRP 的表達情況可能對預(yù)測NSCLC 的耐藥以及預(yù)后有指導(dǎo)意義。LRP 陽性的肺癌細胞耐藥譜廣，尤其對順鉑、阿霉素、足葉乙苷［32］。NSCLC 中LRP mRNA 的陽性表達率也明顯高于正常組織，與細胞分化程度、組織學分級及臨床分期無關(guān)［33］。LRP mRNA 的表達也可以作為NSCLC 耐藥的指標。

3 GST

GST 是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過程中最重要的Ⅱ相代謝酶之一，也是細胞抗氧化還原損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)酶。GST 能單獨與許多抗腫瘤藥物如順鉑、絲裂霉素、阿霉素等結(jié)合，形成一種易排泄的復(fù)合物。當GST呈現(xiàn)高表達水平時可促使藥物從腫瘤細胞排出，最終導(dǎo)致耐藥［34］。因此，GST 是肺癌產(chǎn)生耐藥的機制之一。GST 包括5 種同工酶，其中表達最高的是GST-π［35，36］。GST-π 是繼P-gp、MRP、LRP 后備受關(guān)注的MDR 相關(guān)蛋白，在許多耐藥細胞系中高表達，且表達水平與耐藥程度相關(guān)。NSCLC 癌組織中GST-π 陽性表達水平顯著高于癌旁組織，說明在癌組織中存在由GST-π 介導(dǎo)的原發(fā)性耐藥，且GST-π 可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［37］。GST-π 在腺癌中的陽性率高于鱗癌［24］。GST-π 參與介導(dǎo)NSCLC 的MDR，在NSCLC 中的陽性表達可作為MDR 的指標［38，39］。

4 TOPOⅡ

拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase，TOPO）是存在于細胞核中的重要酶類，分為TOPOⅠ和TOPOⅡ兩類。其中，TOPOⅡ即“回旋酶”，是真核細胞中DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中不可缺少的酶，也是與腫瘤耐藥相關(guān)的主要酶。TOPOⅡ的主要功能表現(xiàn)在兩方面：一是作為與抗腫瘤藥物結(jié)合的靶點，當細胞內(nèi)TOPOⅡ表達水平下降時，會影響化療藥物在抗腫瘤中發(fā)揮作用，導(dǎo)致腫瘤細胞對藥物的敏感性下降，從而產(chǎn)生耐藥；二是作為一個表達G2/M 期細胞的增殖指數(shù)，當其表達增加時意味著腫瘤細胞增殖加快、惡性程度高。TOPOⅡ在NSCLC 組的陽性表達高于對照組，且隨著細胞分化程度的降低表達增強，其表達可作為腫瘤耐藥性的重要指標。宿利清等［40］進行了TOPOⅡ在肺癌耐藥機制中的表達及與化療藥物耐藥相關(guān)性的研究，發(fā)現(xiàn)TOPOⅡ的較低表達與肺癌耐藥有關(guān)，涉及的藥物有順鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺等。因此，TOPOⅡ的較低表達可以作為NSCLC MDR 的指標之一。

除P-gp、MRP、LRP 蛋白、GST 和TOPOⅡ酶外，肺癌的耐藥性還與凋亡基因Bcl-2 基因、p53 基因表達水平有關(guān)，與NF-kB、PI3K/Akt、PKC 信號通路等也有關(guān)。NSCLC 中活化的腫瘤相關(guān)巨噬細胞可以使腫瘤細胞MDR-1 蛋白的表達增加，也與肺癌化療耐藥有關(guān)。

5 中藥逆轉(zhuǎn)NSCLC 耐藥的研究

有關(guān)中藥單體成分、提取物及復(fù)方在逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌耐藥方面的研究表明，中藥可通過降低P-gp 和MRP 能量依賴性藥物排出性膜泵的作用減弱LRP 的細胞核屏蔽功能、降低GST 參與的細胞藥物代謝作用、提高TopoⅡ的活性、改善抗凋亡機制失衡等多種途徑起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。文獻資料中較為常見的有：

5.1 柚皮苷 可通過上調(diào)Bax 和cleaved caspase3 的蛋白水平，下調(diào)Bcl-2 的蛋白水平，劑量依賴性下調(diào)Pgp、MRP1、p-Akt 和CXCR4 的蛋白水平，增強人肺癌A549/DDP 細胞對DDP 的敏感性［41］。

5.2 藤黃酸 通過下調(diào)Bcl-2 和p53 的表達促進細胞凋亡，通過抑制P-gp 表達抑制DDP 的排出增加A549/DDP 細胞對DDP 的敏感性。同時，藤黃酸還作為DDP誘導(dǎo)A549/DDP 細胞凋亡的良好增敏劑，通過增加DDP在細胞內(nèi)積聚和增強DDP 介導(dǎo)的DDP 耐藥肺癌細胞凋亡來增強DDP 的作用［42］。

5.3 芹菜素 可逆轉(zhuǎn)A549/DDP 細胞的耐藥，可能與降低MDR1 mRNA 轉(zhuǎn)錄和下調(diào)P-gp 介導(dǎo)的藥物外轉(zhuǎn)功能有關(guān)［43］。

5.4 雷公藤甲素 可逆轉(zhuǎn)A549/DDP 細胞的MDR，機制可能與抑制Akt/NF-κB 活性，下調(diào)MDR1 和LRP 等MDR 蛋白的表達，增加藥物在腫瘤細胞內(nèi)的濃度，從而逆轉(zhuǎn)耐藥有關(guān)［44］。

5.5 青蒿素 作為NSCLC 耐藥的逆轉(zhuǎn)劑，通過阻止P-gp、BCRP 在體內(nèi)的外排，提高藥物在細胞內(nèi)的濃度，達到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用［45］。

5.6 防己中的β-sitosterol 通過上調(diào)A549/PTX 細胞AR/HSP90 信號通路中的HSP90、KLK3 基因和線粒體/CASP9 凋亡信號通路中的CASP9、CASP3、BCL2、BAX基因，起到逆轉(zhuǎn)NSCLC 的紫杉醇耐藥［46］。

5.7 倍半萜類化合物24 從旋覆花中分離出的倍半萜類化合物24 作為抗紫杉醇耐藥NSCLC A549/PTX的潛在藥物，可以將細胞周期阻滯在G2～M 期，通過線粒體介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細胞遷移和侵襲，起到抗腫瘤活性。還可以通過抑制ABC 家族蛋白中的ABCC1，ABCG2 和MDR1 蛋白的表達來逆轉(zhuǎn)MDR［47］。

5.8 黑沙參生果甲醇糖苷提取物 可通過下調(diào)JAK1、STAT3、pSTAT3 和MDR1 的表達來抑制JAKSTAT3 信號通路，逆轉(zhuǎn)NCI/ADR-RES 細胞的耐藥。黑沙參生果甲醇糖苷提取物可能被用作抗阿霉素耐藥癌癥的化療增敏劑［48］。

6 小結(jié)

隨著分子生物學和相關(guān)學科的快速發(fā)展，對MDR機制的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)新的肺癌MDR 相關(guān)靶點已成為可能。由于腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是一個復(fù)雜的過程，不是單一環(huán)節(jié)和單個機制的問題，因此，通過單一環(huán)節(jié)或單個機制逆轉(zhuǎn)MDR 效果多不顯著。中藥單體成分、提取物及復(fù)方在逆轉(zhuǎn)耐藥機制上可通過單獨或與化療藥物發(fā)揮協(xié)同作用，降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥情況。目前這方面的研究以中藥單體為主，復(fù)方較少。對包括中藥在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥藥物的研發(fā)方面還有大量的工作需要去做。