耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制及流行高危因素的研究進(jìn)展

劉家旭 汪志勇 綜述 劉家宇 審校

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016)

碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺抗生素，因其具有對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點(diǎn)，細(xì)菌對(duì)該類藥物不存在交叉耐藥性，因而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌及厭氧菌都有強(qiáng)大的抗菌活性[1]。國(guó)內(nèi)已經(jīng)上市的品種有亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南及多尼培南等，該類藥物已經(jīng)成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一。然而由于目前臨床上對(duì)于碳青霉烯類抗生素的過度依賴，世界各地相繼出現(xiàn)多種耐碳青霉烯類耐藥菌的報(bào)道，對(duì)于臨床治療帶來了很大挑戰(zhàn)，本文從耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌的耐藥機(jī)制及臨床流行感染高危因素進(jìn)行綜述。

1 碳青霉烯類抗生素的分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

碳青霉烯類抗生素其分子結(jié)構(gòu)與青霉素類的青霉環(huán)相似，不同之處在于噻唑環(huán)上的硫原子為碳，且C2與C3之間存在不飽和雙鍵，另外，其6位羥乙基側(cè)鏈為反式構(gòu)象。研究[2]證明，正是這個(gè)構(gòu)型特殊的基團(tuán)，使該類化合物與通常青霉烯的順式構(gòu)象顯著不同，具有超廣譜的、極強(qiáng)的抗菌活性，以及對(duì)β-內(nèi)酰胺酶高度的穩(wěn)定性。碳青霉烯類抗生素作用方式都是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)，從而阻礙細(xì)胞壁粘肽合成，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹致使細(xì)菌胞漿滲透壓改變和細(xì)胞溶解而殺滅細(xì)菌。近十多年來已證實(shí)細(xì)菌胞漿膜上特殊蛋白PBPs是此藥的作用靶位，比如亞胺培南與PBP的結(jié)合，尤其是PBP2的親和力很強(qiáng)，阻礙細(xì)胞壁的合成，可使細(xì)菌迅速腫脹、溶解。美羅培南能迅速滲透入腸桿菌科和銅綠假單孢菌靶位，主要是與PBP2和PBP3緊密結(jié)合。帕尼培南對(duì)金葡菌的作用靶位PBP1和PBP3，對(duì)大腸桿菌、粘質(zhì)沙霉菌和銅綠假單孢菌作用靶位為PBP2[3]。

2 CRE主要耐藥機(jī)制

2.1產(chǎn)碳青霉烯酶 腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的機(jī)制就是產(chǎn)生碳青霉烯酶水解碳青霉烯類抗菌藥物。目前人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了碳青霉烯類酶共A、B、D三類酶，其中 A、D類為非金屬碳青霉烯酶，B類為金屬碳青霉烯酶[4]。臨床上分離的、最常見的A 類碳青霉烯酶基因型包括blaKPC、blaSME和blaGES，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(klebsiellapneumoniae-carbapenemase，KPC)占大多數(shù)[5]，常見流行的基因型為blaKPC-2，blaKPC-2基因型在臨床上的分離率最高。B類碳青霉烯酶是金屬酶類的β-內(nèi)酰胺酶，是研究最多的碳青霉烯酶，所包含的產(chǎn)酶基因型為blaNDM，blaIMP，blaVIM三類，B類碳青霉烯酶對(duì)碳青霉烯酶的水解活力高于其他廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。D類碳青霉烯酶由blaOXA 等位基因編碼，該酶主要存在于鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌中[6]，在腸桿菌中也有一定分布但分布率較低，最常見的為blaOXA-48類耐藥基因型，其臨床分離率在blaOXA家族中最高[7]。

2.2外膜孔蛋白缺失 膜孔蛋白是存在于細(xì)菌質(zhì)膜外膜、線粒體外膜上的通道蛋白，它們?cè)试S較大的分子(如蛋白質(zhì)、rRNA)通過，膜孔蛋白是膜整合蛋白，它的膜脂結(jié)合區(qū)與其他的跨膜蛋白不同，不是α螺旋，而是β折疊。革蘭陰性菌被一層具有通透性的外膜包繞著，外膜約60%的表面覆蓋膜孔蛋白，聚合起來形成孔道。膜孔蛋白是跨膜蛋白通過重組形成的充滿水分的孔道，常以同三聚體的形式存在，允許親水性物質(zhì)包括大多數(shù)抗生素跨膜擴(kuò)散。膜孔蛋白主要有五種:OmpF、OmpC、PhoE、LamB和蛋白K。大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素可通過的膜孔蛋白為OmpF和OmpC，其特點(diǎn)為對(duì)帶有負(fù)電荷的物質(zhì)通透性明顯降低。而正電荷則可促進(jìn)溶質(zhì)通過。OmpF的通透性較OmpC高10倍[8]。膜孔蛋白的變異可引起細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的下降。碳青霉烯類抗生素分子是較大的分子，革蘭氏陰性桿菌外膜孔蛋白只允許較大的分子進(jìn)入細(xì)菌。當(dāng)細(xì)菌外膜孔蛋白缺失或減少時(shí)，進(jìn)入細(xì)菌的抗生素分子的量減少，并且不產(chǎn)生抗生素效應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[9]。有研究[10]提出在肺炎克雷伯菌中，OmpK35是β-內(nèi)酰胺類的重要膜孔蛋白。

2.3菌體主動(dòng)外排泵表達(dá) 外排泵是細(xì)菌細(xì)胞膜上的一種蛋白質(zhì)。細(xì)菌菌體的細(xì)胞主動(dòng)外排泵系統(tǒng)是形成多重耐藥性的生物學(xué)基礎(chǔ)?？剐詸C(jī)制的原因是外排泵的過度表達(dá)，并且抗菌藥物及其代謝物被選擇性地或非選擇性地從細(xì)菌中泵出。腸桿菌科細(xì)菌外排泵過度表達(dá)的結(jié)果就會(huì)使敏感類細(xì)菌轉(zhuǎn)化發(fā)展成多重耐藥細(xì)菌，敏感菌發(fā)展為耐藥菌的第一步就是外排泵的過度表達(dá)；研究[11]表明，鮑曼不動(dòng)桿菌的RND家族即抗藥小結(jié)分裂區(qū)(resistance nodulation division，RND)家族是不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌最主要也是最早發(fā)現(xiàn)的外排泵系統(tǒng)，由于其外排底物的廣泛性，外排泵的過度表達(dá)可使更多的抗菌藥物被排出菌體外，從而引起多重耐藥外排泵。

2.4細(xì)菌生物膜系統(tǒng) 細(xì)菌生物膜(BF)是由細(xì)菌吸附在生物材料和體腔中以適應(yīng)生活環(huán)境而形成的一層蛋白基質(zhì)混合膜。主要成分是菌體自我分泌的脂蛋白、纖維蛋白和多糖基質(zhì)，主要是相同的粘液狀非均相聚合物基質(zhì)。法國(guó)諾曼底大學(xué)的研究[12-13]報(bào)道分析了動(dòng)態(tài)條件下鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜系統(tǒng)的形成，并測(cè)試了抗生素的活性，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌，銅綠假單胞菌以及陰溝桿菌等生物膜系統(tǒng)的耐藥機(jī)制進(jìn)行了介紹，生物膜的主要作用是產(chǎn)生生物屏障作用，以降低抗生素的滲透性，抵抗抗菌藥物進(jìn)入細(xì)胞，并引起抗性。

3 流行高危因素

3.1傳播途徑 CRE的耐藥性和毒力因子在病區(qū)內(nèi)主要通過質(zhì)粒傳播，在亞洲一些衛(wèi)生設(shè)施條件較差的國(guó)家CRE除了遵循醫(yī)院獲得性病原體的傳播模式外，還通過糞—口途徑傳播、水傳播和食源性傳播。韓國(guó)的一條城鎮(zhèn)河流[14]和印度的飲用水、地下水以及越南的地下水[15]中都有檢出CRE。我國(guó)有研究[16]報(bào)道在某些醫(yī)院污水中檢出CRE，這充分表明了CRE的入水傳播性質(zhì)，提醒在CRE防控時(shí)還應(yīng)做相關(guān)水源的監(jiān)測(cè)。食源性傳播最近在印度則被報(bào)道，研究人員從海鮮中分離出了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[17]；腸桿菌科細(xì)菌的傳播方式在院內(nèi)感染傳播是主要獲得性傳播方式，其中ICU病區(qū)中CRE的感染主要在于病原體通過患者的定植或者偶發(fā)感染，并在不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)之間通過患者流動(dòng)導(dǎo)致傳播。比如從門診流入普通病房，再由普通病房流入重癥監(jiān)護(hù)病房，由院區(qū)流行形成區(qū)域爆發(fā)。

3.2感染因素

3.2.1重癥監(jiān)護(hù)病房(important care unit，ICU)是CRE感染的高風(fēng)險(xiǎn)病區(qū) 外文文獻(xiàn)報(bào)道，美國(guó)部分地區(qū)的三級(jí)重癥?？漆t(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房的CRE感染率范圍處于1.5%～8.7%之間，而非CRE感染率在0.9%～4.9%，二者存在明顯差異。同時(shí)據(jù)資料分析發(fā)現(xiàn)，機(jī)械通氣、肺部疾病、抗菌藥物治療及CRE定植壓力均是CRE 感染的影響因素，其中CRE定植壓力指病房里CRE定植率，定植率每增加1%，感染CRE的風(fēng)險(xiǎn)增加15%，所以主動(dòng)監(jiān)測(cè)CRE定植壓力十分必要[18]。美國(guó)北卡羅萊納州的一家長(zhǎng)期監(jiān)護(hù)病房患者長(zhǎng)期臥床引發(fā)CRE感染并引起了整個(gè)社區(qū)的爆發(fā)，長(zhǎng)期臥床患者是感染高危因素之一。侵入性導(dǎo)管因素在呼吸重癥病房所導(dǎo)致CRE感染發(fā)生率最高，這與呼吸重癥病房患者呼吸類疾病如重癥肺炎，呼吸衰竭，呼吸窘迫綜合征等嚴(yán)重程度，氣管插管開放性嵌入有很大關(guān)系[19]。重癥監(jiān)護(hù)病房是CRE的高危區(qū)域，重癥疾病狀態(tài)、長(zhǎng)時(shí)間住院、長(zhǎng)時(shí)間的抗菌藥物使用(特別是碳青霉烯類)、侵入性醫(yī)療操作(侵入性內(nèi)鏡、手術(shù)、各種穿刺操作等)、人工材料置入、CRE定植壓力是比較明確的風(fēng)險(xiǎn)因素。

3.2.2易感人群分類 我國(guó)三級(jí)甲等綜合醫(yī)院回顧性分析患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)新生兒及兒童，入住ICU的重癥患者，腫瘤和器官移植患者，老年患者以及患有嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病和糖尿病的患者等免疫力低下群體是CRE感染的易感高危人群。(1)新生兒和兒童患者：免疫功能低下的新生兒和兒童患者最易受CRE的感染；一些研究[20-21]對(duì)河南省兒童醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室肺炎克雷伯菌分布和耐藥性做出了分析，其中耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌分離率達(dá)到41.2%，CRE對(duì)頭孢菌素類藥物的耐藥率普遍已達(dá) 100%。新生兒及兒童患者多器官尚未發(fā)育成熟而免疫功能低下，當(dāng)存在嚴(yán)重疾病、免疫缺陷、長(zhǎng)期住院(尤其入住 NICU)、侵襲性診療操作以及廣譜抗菌藥物的應(yīng)用時(shí)，CRE在該群體流行播散情況不容樂觀。(2)入住ICU的重癥患者：入住ICU的重癥患者人群因重癥疾病狀態(tài)，接受治療手段以及ICU復(fù)雜環(huán)境，是被CRE感染的主要人群；北京大學(xué)人民醫(yī)院陳美戀通過對(duì)2016～2017年入住外科ICU、急診ICU和呼吸ICU的重癥患者建立主動(dòng)篩查組和未主動(dòng)篩查組，對(duì)各部位拭子標(biāo)本(直腸拭子、咽拭子、腋下拭子、鼻拭子)進(jìn)行主動(dòng)篩查。該研究中CRE主動(dòng)篩查率為68.23%，患者主動(dòng)篩查CRE的定植率4.22%，分離菌以 CRKP(耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌)為主，得出了重癥ICU患者人群易感的結(jié)論[22]。由于ICU復(fù)雜的環(huán)境，若醫(yī)務(wù)人員未能將病區(qū)感染加以正確預(yù)防控制，CRE很容易通過重癥患者的消化系統(tǒng)，血液系統(tǒng)途徑進(jìn)行侵襲感染。(3)其它免疫力低下人群：免疫力低下被明確為感染CRE的重要因素之一，通常臨床科室中造成免疫力低下的原因還包括腫瘤患者放化療，實(shí)體器官和干細(xì)胞移植患者術(shù)后使用免疫抑制劑，年齡>70歲老年患者的免疫功能退化，消化系統(tǒng)嚴(yán)重疾病導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)以及糖尿病患者合并并發(fā)癥感染等。類似于這類患者也是感染易發(fā)人群，其中腫瘤科和干細(xì)胞移植中心等區(qū)域有相關(guān)流行報(bào)道[23-24]。

3.2.3CRE檢出來源 在張艷君等[25]的研究中，2013～2014年上海長(zhǎng)海醫(yī)院所分離的CRE主要分離自呼吸道，占33.6%，其次為其他無菌體液和分泌物，分別占16.0%和15.7%。馮旭慧的研究[26]顯示，浙江余姚第四人民醫(yī)院2012～2014兩年間所有檢出CRE菌株66株標(biāo)本中，痰液檢出占74.2%，其次是滲出物占16.7%，血液占4.5%，尿液占3.0%，膽汁占1.5%。呼吸道標(biāo)本主要為痰、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液，由此可見呼吸道標(biāo)本的高分離率與呼吸內(nèi)科ICU的高CRE檢出率呈現(xiàn)良好對(duì)應(yīng)關(guān)系，臨床常見耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)主要分離自痰液。國(guó)外的研究[27]幾年前將直腸拭子主動(dòng)篩查CRE納入研究范圍，發(fā)現(xiàn)直腸中CRE定植率較高，直腸拭子目前在國(guó)內(nèi)正逐漸提上研究日程。

3.2.4分離病原菌及主要耐藥基因型別 近年來CRE對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率不斷增加，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的檢出種類，檢出數(shù)量也隨之增長(zhǎng)。中國(guó)CRE監(jiān)測(cè)網(wǎng)一項(xiàng)多中心聯(lián)合研究[28]覆蓋中國(guó)大陸14個(gè)省的25家三級(jí)甲等醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，在664例CRE病例中，分離病原菌大多數(shù)為肺炎克雷伯菌(73.9%)，其次是大腸埃希菌(16.6%)和陰溝腸桿菌(7.1%)，肺炎克雷伯菌在臨床上分離率最高，傳播也最廣。同時(shí)顯示CRE感染發(fā)生率為每10 000人中有4人感染，地區(qū)差異顯著，其中感染發(fā)生最高在江蘇(14.97/10 000)，最低在青海(0.34/10 000)，不同地區(qū)的人口密度與CRE的感染率可能呈現(xiàn)一定關(guān)系。CRE的產(chǎn)酶耐藥基因型別有五類，分別為blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA及blaNDM，當(dāng)下研究最多的產(chǎn)酶基因型別鑒定技術(shù)Gene Xpert以及常規(guī)PCR方法能鑒定到亞基因型，分離最多的耐藥亞基因型別為blaKPC-2和blaNDM-1，二者在國(guó)外的GeneXpert方法學(xué)驗(yàn)證報(bào)道中被經(jīng)常提及[27,29]。

4 總 結(jié)

美國(guó)傳染病中心 (communicable disease center,CDC)在2015年再次修訂CRE防控指南，指出美國(guó)近50%的醫(yī)院患者因?yàn)镃RE感染而死亡，CRE已經(jīng)被美國(guó)歐洲列為嚴(yán)重緊迫的公共健康威脅，并建議對(duì)高危人群進(jìn)行主動(dòng)篩查。產(chǎn)碳青霉烯酶，外膜孔蛋白缺失，菌體主動(dòng)外排泵表達(dá)和細(xì)菌生物膜系統(tǒng)是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的主要四類原因。這可能是單個(gè)耐藥機(jī)制的結(jié)果，也可能是聯(lián)合耐藥機(jī)制的結(jié)果。臨床上所分離的CRE中,產(chǎn)碳青霉烯酶為CRE的主要耐藥機(jī)制，也是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，為減少耐碳青霉烯酶類細(xì)菌的產(chǎn)生，臨床醫(yī)生應(yīng)謹(jǐn)慎、合理地選擇性使用碳青霉烯類抗菌藥物，嚴(yán)格根據(jù)患者適應(yīng)證選用藥物。我國(guó)仍存在醫(yī)療資源分布不均，醫(yī)院水平參差不齊，基礎(chǔ)衛(wèi)生設(shè)備較差的問題。CRE的耐藥性和毒力因子在病區(qū)內(nèi)主要通過質(zhì)粒傳播，在防止傳播過程中人群應(yīng)注意水衛(wèi)生，食物環(huán)境衛(wèi)生以及接觸衛(wèi)生，醫(yī)務(wù)工作者的工作重點(diǎn)在于手衛(wèi)生、環(huán)境的消毒滅菌、接觸隔離措施、對(duì)感染和定植患者的密切監(jiān)測(cè)、抗菌藥物合理管理、衛(wèi)生人員的教育和培訓(xùn)等方面。特別在ICU病區(qū)，CRE的感染發(fā)生率明顯高于普通病區(qū)，這與ICU病區(qū)患者的重癥疾病狀態(tài)、長(zhǎng)的住院時(shí)間、多次抗菌藥物使用(特別是碳青霉烯類)、侵入性醫(yī)療操作等具有顯著關(guān)系，ICU病區(qū)是我們應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)。分離的病原菌中大部分標(biāo)本來源于呼吸道，痰液是主要分離來源標(biāo)本，重癥肺炎，呼吸衰竭類患者最常見，這提示醫(yī)院呼吸病區(qū)尤其是呼吸內(nèi)科ICU為感染重災(zāi)區(qū)，常態(tài)化的CRE檢測(cè)和主動(dòng)干預(yù)應(yīng)提上該病區(qū)工作日程。2006年以色列出現(xiàn)過全國(guó)范圍內(nèi)的CRE疫情爆發(fā)，以色列國(guó)家衛(wèi)生部門通過合理制定防控治療策略成功控制該次疫情[30]，我國(guó)CRE的感染率近年來不斷增高，新型突變的耐藥菌株也偶有報(bào)道，形勢(shì)不容樂觀。國(guó)家和地區(qū)衛(wèi)生部門層面應(yīng)統(tǒng)一協(xié)調(diào)各級(jí)醫(yī)院制定防控策略，可分區(qū)劃分重點(diǎn)控制區(qū)域，成立逐級(jí)防控網(wǎng)和監(jiān)測(cè)網(wǎng)。醫(yī)院更應(yīng)該將防控培訓(xùn)教育從主管醫(yī)生落實(shí)到管床護(hù)士，清潔護(hù)工，直至患者，建立完善的控制鏈。分析CRE根本的耐藥機(jī)制可為臨床合理利用藥物和新藥設(shè)計(jì)開發(fā)提供參考，分析其流行高危因素以多方面提高防控策略，CRE防控必將取得根本性進(jìn)步和發(fā)展。