關(guān)節(jié)液來源間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程中應(yīng)用研究進(jìn)展

黃勇 陳斐 楊遠(yuǎn) 劉雨微 蘇帆 傅子財 謝都 陳康 馮文哲 鄧楨翰 陸偉 朱偉民

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見疾病，損傷后通常難以自行愈合，患者常出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、水腫及功能受限[1]，并可發(fā)生慢性退行性病變。近年，軟骨組織工程如自體軟骨細(xì)胞移植、基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植等成為軟骨損傷的重要治療方法[2]。選擇理想的種子細(xì)胞是軟骨組織工程的研究熱點之一。

2004年，Jones等[3]首次報道在骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者關(guān)節(jié)液中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(SF-MSC)，并證實其具有很強的成軟骨能力。此外，有學(xué)者從踝關(guān)節(jié)及顳下頜關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液中也分離得到SF-MSC[4-5]。SF-MSC通過關(guān)節(jié)液易于獲取，其具有分化為軟骨組織、脂肪組織及骨組織的潛能[6]。在關(guān)節(jié)韌帶損傷、軟骨損傷、早期OA患者的關(guān)節(jié)液中，SF-MSC數(shù)量顯著增加[7-9]。與其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)相比，SF-MSC可從關(guān)節(jié)液中獲得，提取方式創(chuàng)傷更小而其成軟骨分化能力更強，因而成為更具應(yīng)用前景的組織工程種子細(xì)胞。大量研究已使用SF-MSC作為種子細(xì)胞應(yīng)用于軟骨損傷治療，并取得良好效果[6,10-11]。

1 SF-MSC來源與生物學(xué)特性

分離SF-MSC首先需獲取關(guān)節(jié)液。關(guān)節(jié)液較多時可直接使用注射器抽??；關(guān)節(jié)液較少時，可先注入生理鹽水，活動關(guān)節(jié)后抽出灌洗液。此外，也可以在關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中收集關(guān)節(jié)沖洗液[6,8]。將收集的關(guān)節(jié)液過濾除去雜質(zhì)，梯度離心后棄去上清液，然后以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。由于SF-MSC具有貼壁生長的特性，通常在培養(yǎng)4 h后細(xì)胞貼壁，棄去上清液即可分離得到SF-MSC。一些學(xué)者采用不同方法獲得SF-MSC，如通過磁激活細(xì)胞分選法分離純化表達(dá)CD90的SF-MSC[12]；采用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆化培養(yǎng)，純化SF-MSC[13]。

國際細(xì)胞治療學(xué)會(ISCT)制定的MSC鑒定標(biāo)準(zhǔn)包括：①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下可貼壁生長；②表達(dá)CD105、CD73、CD90，不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、人白細(xì)胞抗原-DR；③具備成脂分化、成骨分化、成軟骨分化能力[14]。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，已有較多學(xué)者從人及兔、馬、豬等動物的關(guān)節(jié)液中成功分離SF-MSC[6,11,15-16]。此外，有學(xué)者還檢測到CD44、CD49c、CD49f、CD151、CD140、CD146等細(xì)胞表面分子的表達(dá)，高表達(dá)這些細(xì)胞分子的干細(xì)胞更易成軟骨分化[17-18]。干細(xì)胞有自我更新能力，可表達(dá)多能性相關(guān)基因Nanog、Oct4、Sox2[19]。Jia等[20]通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測序分析發(fā)現(xiàn)，SF-MSC與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在某些基因表達(dá)上存在明顯差異，這可能與它們在多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)特性和組織修復(fù)能力等細(xì)胞生物學(xué)特性上存在差異相關(guān)。Mazzotti等[21]研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡馬的SF-MSC的成軟骨分化能力、增殖能力以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有明顯變化，提示在研究時應(yīng)充分考慮年齡對于SF-MSC生物學(xué)性能的影響。

Schofield[22]將MSC所處環(huán)境稱為“niche”，其作用包括維持MSC的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、增殖能力和細(xì)胞數(shù)量。由此可見，微環(huán)境對維持MSC生物學(xué)特性起著重要作用。

2 SF-MSC成軟骨分化潛能

成軟骨分化能力是MSC用于軟骨修復(fù)的重要指標(biāo)之一，決定著其軟骨修復(fù)能力。有學(xué)者將自O(shè)A和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中分離的SF-MSC進(jìn)行成骨、成脂、成軟骨分化的研究，發(fā)現(xiàn)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)相比，SF-MSC的成軟骨分化能力較強，而成骨分化能力較弱[3]。在隨后的研究中，他們將牛來源的SF-MSC與BMSC進(jìn)行比較，結(jié)果顯示SF-MSC的成軟骨能力更強，再次證實SF-MSC較BMSC更適合用于組織工程[23]。研究發(fā)現(xiàn)，SF-MSC高表達(dá)CD44，而CD44是透明質(zhì)酸受體，具有促進(jìn)成軟骨分化的能力[17,24]。通過檢測特定的細(xì)胞表面分子，能夠篩選出具有更強軟骨分化能力的干細(xì)胞[12]。

有研究認(rèn)為，與非關(guān)節(jié)組織來源的MSC相比，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Syn-MSC)、SF-MSC等關(guān)節(jié)組織來源的MSC成軟骨分化能力更優(yōu)[25]。近期研究發(fā)現(xiàn)，SF-MSC的成軟骨分化能力和關(guān)節(jié)軟骨再生能力與Syn-MSC相當(dāng)，在小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中分別移植SF-MSC與Syn-MSC，兩者均有很好的軟骨修復(fù)作用，而SF-MSC更易獲取，因而被認(rèn)為是組織工程更適合的種子細(xì)胞[26]。

Bertram等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與正常關(guān)節(jié)來源的SF-MSC相比，來自O(shè)A患者病變關(guān)節(jié)的SF-MSC成軟骨分化能力明顯降低，認(rèn)為這可能由于這些病變關(guān)節(jié)處關(guān)節(jié)液滲透壓降低所致。同樣，Krawetz等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，與來自O(shè)A病變關(guān)節(jié)的SF-MSC相比，正常關(guān)節(jié)來源的SF-MSC更容易成軟骨分化。OA是多因素引起的關(guān)節(jié)病變，因此OA病變關(guān)節(jié)來源SF-MSC的表型也受多種因素影響。Bertram等[29]研究發(fā)現(xiàn)，OA病變關(guān)節(jié)與正常關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液中離子濃度存在明顯差異，離子通道蛋白表達(dá)也有明顯改變，這些成為影響SF-MSC功能的因素之一。

Ando等[30]通過比較同一供體來源的SF-MSC、Syn-MSC、BMSC、皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨能力發(fā)現(xiàn)，SF-MSC與Syn-MSC的成軟骨能力相似，但較BMSC或皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨能力更強。Zayed等[15]對健康馬進(jìn)行研究，比較SF-MSC與BMSC的增殖能力、細(xì)胞表面分子表達(dá)和成軟骨能力,發(fā)現(xiàn)經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)，SF-MSC較BMSC表達(dá)更多的黏多糖，有更強的成軟骨能力。

成軟骨分化過程需通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路精細(xì)調(diào)控，易受多種因素影響。對成軟骨分化機制的研究能更好地理解不同來源MSC的生物學(xué)差異。

3 SF-MSC在組織工程中的應(yīng)用

目前，學(xué)者們已在豬、鼠、兔等軟骨缺損動物模型中開展實驗研究，驗證SF-MSC對軟骨修復(fù)的有效性，造模時主要通過特殊鉆頭在股骨髁間的非負(fù)重區(qū)域去除一定直徑的全層軟骨[31]。SF-MSC需先在體外擴增，經(jīng)表型鑒定和分化潛能鑒定后移植入體內(nèi)。移植方法主要為注射法與復(fù)合支架材料移植法，軟骨修復(fù)效果的評估主要通過國際軟骨修復(fù)協(xié)會(ICRS)評分和Ⅱ型膠原成分組織學(xué)鑒定。

生物支架材料是組織工程中細(xì)胞移植的載體之一，可為細(xì)胞提供三維立體的生長分化環(huán)境，有利于修復(fù)缺損的組織結(jié)構(gòu)。Chiang等[16]采用豬SF-MSC混合富血小板血漿(PRP)和溫敏水凝膠修復(fù)豬股骨軟骨損傷，修復(fù)后第4周和第8周進(jìn)行組織學(xué)分析，結(jié)果顯示SF-MSC聯(lián)合PRP和溫敏水凝膠可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的再生和成熟。Zayed等[32]將復(fù)合馬SF-MSC或BMSC的中性瓊脂糖支架移植至鼠股骨滑車軟骨缺損處進(jìn)行軟骨修復(fù)，12周后形態(tài)學(xué)和組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，MSC與中性瓊脂糖支架復(fù)合對軟骨修復(fù)效果更優(yōu)，并且修復(fù)的軟骨組織中Ⅱ型膠原含量更高，提示為透明樣軟骨修復(fù)。該實驗證實SF-MSC具有促進(jìn)軟骨修復(fù)的能力。同樣，Li等[6]從關(guān)節(jié)鏡沖洗液中分離SF-MSC，將其與水凝膠結(jié)合，移植到鼠股骨滑車全層軟骨缺損模型中進(jìn)行軟骨修復(fù)，8周后將鼠處死，取股骨修復(fù)處的軟骨組織進(jìn)行組織學(xué)分析，結(jié)果顯示軟骨修復(fù)平整，免疫組化染色可見Ⅱ型膠原表達(dá)，形成透明軟骨修復(fù)。

注射法為新的MSC移植方法，許多研究以此方式治療OA已經(jīng)取得良好效果，關(guān)節(jié)內(nèi)MSC注射治療簡便安全。Jia等[33]的研究先在體外擴增SF-MSC，然后將其注射于兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型，每周1次，共4次，在第8周和第12周切取再生軟骨進(jìn)行組織學(xué)分析，觀察到缺損軟骨完全再生修復(fù)。另一項研究中他們將SF-MSC與殼聚糖水凝膠混合，注射至軟骨缺損部位，12周后發(fā)現(xiàn)兔軟骨得到完全透明樣軟骨修復(fù)[11]。有學(xué)者通過切斷裸鼠前交叉韌帶制造OA模型，然后在關(guān)節(jié)內(nèi)注射人SF-MSC進(jìn)行軟骨修復(fù)，結(jié)果顯示與對照組相比，實驗組并沒有明顯的軟骨修復(fù)，認(rèn)為關(guān)節(jié)內(nèi)注射SF-MSC并不能修復(fù)OA的損傷軟骨[10]。

目前研究表明，SF-MSC可有效修復(fù)軟骨損傷，是理想的種子細(xì)胞來源。部分研究通過移植異種SF-MSC進(jìn)行軟骨修復(fù)，未發(fā)現(xiàn)移植造成的不良事件，表明異種來源的SF-MSC同樣可有效修復(fù)軟骨缺損。

4 展望

盡管大量文獻(xiàn)報道SF-MSC是軟骨缺損修復(fù)和治療OA的理想種子細(xì)胞，但仍有很多問題亟待解決。首先，如何獲得足夠數(shù)量具有治療效果的SF-MSC。其次，SF-MSC修復(fù)軟骨損傷的機制尚不明確。第三，尚缺乏SF-MSC應(yīng)用于臨床治療的研究報道。

SF-MSC作為軟骨組織工程中新出現(xiàn)的種子細(xì)胞，其應(yīng)用有兩大優(yōu)勢：第一，關(guān)節(jié)液容易獲取，創(chuàng)傷小，在門診即可完成關(guān)節(jié)液抽??；第二，SF-MSC成軟骨分化能力強?；谝陨蟽?yōu)點，SF-MSC應(yīng)用于軟骨組織工程有更廣闊的前景。