液體活檢在早期HCC診斷中的應(yīng)用

鄭立威 袁荻森 劉佳 魯鳳民

在我國的常見惡性腫瘤中，原發(fā)性肝癌居第4位，腫瘤致死病因的第2位，嚴(yán)重危害國人健康[1]。肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌的主要病理類型，在我國，約86%的HCC與乙型肝炎病毒(HBV)感染相關(guān)[2]。對(duì)于早期肝癌患者，通過肝切除術(shù)在內(nèi)的根治性治療可顯著改善預(yù)后。然而，HCC發(fā)病隱匿，患者被診斷時(shí)多已在晚期，預(yù)后差。

肝臟超聲檢查(US)聯(lián)合血清甲胎蛋白(AFP)是目前對(duì)HCC高危人群進(jìn)行肝癌篩查的主要措施。隨著影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，螺旋CT、PET-CT等檢查及異常凝血酶原(DCP)、血清甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)等新的血液分子標(biāo)志物的應(yīng)用，肝癌診斷的敏感性和特異性有所提高，但臨床上對(duì)早期HCC的診斷能力仍十分有限，因此亟待尋找一種檢測(cè)早期HCC的新型診斷手段。

液體活檢是近年來研究較多、技術(shù)逐漸完善的一種新型診斷方法，通過對(duì)體液(血液、尿液、淚液)中包含疾病信息的成分，如細(xì)胞外囊泡、循環(huán)核酸等進(jìn)行分析，以獲取患者疾病狀態(tài)相關(guān)信息。液體活檢樣本獲取方便，檢測(cè)靈敏度高、特異性好，有較大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

一、細(xì)胞游離DNA

細(xì)胞游離DNA(cfDNA)是一類長(zhǎng)度120～160 bp的DNA片段，主要來源于凋亡或壞死細(xì)胞。腫瘤患者血液中的cfDNA主要來源于壞死的腫瘤細(xì)胞，這部分DNA與其來源的腫瘤細(xì)胞具有相同的突變類型。對(duì)HCC患者血清中的cfDNA進(jìn)行深度測(cè)序能夠檢測(cè)到在HCC中高頻突變的癌基因及抑癌基因。

(一)cfDNA突變 Cohen 等[3]建立的“CancerSEEK”方法利用61-擴(kuò)增子板多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增樣本，進(jìn)而對(duì)包括肝癌在內(nèi)的8種腫瘤中的16個(gè)高頻突變基因進(jìn)行分析，并通過單分子免疫檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)8種蛋白標(biāo)志物(每種標(biāo)志物在至少一種腫瘤中高表達(dá))，能有效、可靠地從健康對(duì)照中鑒別腫瘤患者。結(jié)果顯示，在44例肝癌患者中(89%為HCC)，CancerSEEK特異度為60%，靈敏度為97%，對(duì)其中5例早期肝癌患者(I期)的診斷靈敏度為100%。

全球超過50%的原發(fā)性肝癌與HBV感染有關(guān)。Qu等[4]通過聯(lián)合循環(huán)cfDNA上的體細(xì)胞突變、HBV整合、cfDNA濃度及血液中的蛋白標(biāo)志物(AFP和DCP)與年齡、性別等多種因素，開發(fā)出了一種能夠診斷早期HCC的液體活檢方法 “HCCscreen”。 他們首次對(duì)HCC高危人群進(jìn)行分析，將HBsAg(+)、血液AFP> 20 ng/mL或/和US檢測(cè)到肝臟存在可疑結(jié)節(jié),但增強(qiáng)MRI/CT未診斷HCC的患者定義為高危人群。在這類高危人群組成的訓(xùn)練集中，HCCscreen具有良好的診斷效能(AUROC=0.93；靈敏度85%，特異度93%)。在331例AFP正常、US無可疑結(jié)節(jié)的HBsAg(+)患者中，成功鑒定出了4例HCC患者，這些患者均處于疾病早期(結(jié)節(jié)<3 cm)，診斷靈敏度為100%(4/4)，特異度為94%(307/327)，陽性預(yù)測(cè)值為17%。但 “HCCscreen”是否適用于HBsAg陽性者之外的其他人群，有待驗(yàn)證。

(二)cfDNA表觀遺傳學(xué)改變 近年來發(fā)現(xiàn)，cfDNA特定基因的異常甲基化及羥甲基化修飾可作為HCC的診斷標(biāo)志物。由于甲基化修飾帶來的基因沉默效應(yīng)，HCC患者cfDNA異常甲基化主要出現(xiàn)在HCC相關(guān)的抑癌基因上?？紤]到腫瘤患者cfDNA上同樣可檢測(cè)到與原發(fā)腫瘤細(xì)胞相一致的甲基化及羥甲基化修飾改變，Xu等[5]開發(fā)的10個(gè)基因甲基化標(biāo)志物組合能從健康對(duì)照、HBV/HCV感染患者、脂肪肝患者中鑒別HCC患者，其靈敏度與US相當(dāng)；該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的由8個(gè)基因甲基化標(biāo)志物組成的聯(lián)合預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)還能用于HCC患者預(yù)后預(yù)測(cè)，從而調(diào)整患者治療方案。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，包括肝癌在內(nèi)的不同腫瘤細(xì)胞來源的甲基化cfDNA在患者出現(xiàn)臨床癥狀前即可存在于患者血液[6]。近期Chen等[6]開發(fā)了一項(xiàng)基于cfDNA甲基化的多癌篩查技術(shù)“PanSeer”，該技術(shù)通過半靶向PCR技術(shù)構(gòu)建cfDNA測(cè)序文庫，解決了傳統(tǒng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行甲基化測(cè)序時(shí)DNA損失率較高、靈敏度低等問題，能夠高效、靈敏地檢測(cè)微量cfDNA上477個(gè)基因組區(qū)域中10 613個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況。在98例未確診腫瘤之前1～4年采集的患者血液樣本中，該診斷方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)95%。

除甲基化外，近年來研究人員也注意到cfDNA羥甲基化修飾在HCC診斷中的潛在作用。DNA羥甲基化是甲基化DNA的5-甲基胞嘧啶被催化形成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)的過程，5-hmC可作為一種穩(wěn)定的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體重編程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Cai等[7]從血漿cfDNA中篩選了由32個(gè)基因組成的5-hmC標(biāo)志物組合，基于此開發(fā)的加權(quán)診斷模型被證明可用于HCC患者與健康人及其他腫瘤患者的鑒別。

二、循環(huán)非編碼RNA

非編碼RNA(ncRNA)由長(zhǎng)度>200 bp的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和長(zhǎng)度在18～22 nt的微小RNA(miRNA)構(gòu)成，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化伴隨lncRNA、miRNA的表達(dá)異常。其中存在于體液中的循環(huán)miRNA是研究最廣泛的一種短鏈ncRNA。Zhou等[8]檢測(cè)了934例參與者，其中包括健康受試者、慢性乙型肝炎(CHB)患者、肝硬化(LC)患者和HBV相關(guān)HCC患者，包含miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a和miR-801在內(nèi)的一組miRNA能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同BCLC分期的HCC患者，靈敏度和特異度分別達(dá)到了82%和84%。該組miRNA同樣準(zhǔn)確區(qū)分了HCC患者與健康受試者、CHB和肝硬化患者。

Tan等[9]對(duì)來自血漿和外泌體的RNA進(jìn)行了測(cè)序、分析，發(fā)現(xiàn)除miRNA外，多種血漿ncRNA亦可作為HCC診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。這類血漿ncRNA可能因?yàn)樘厥獾亩?jí)結(jié)構(gòu)或與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合而未被RNA酶降解，具有生物學(xué)活性，如其中的RN7SL1 S片段可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并發(fā)現(xiàn)這些循環(huán)ncRNA能夠靈敏、特異地區(qū)分HCC、CHB和健康受試者。

三、細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡(EVs)可由細(xì)胞主動(dòng)釋放至細(xì)胞外環(huán)境，包含多種具有生物活性的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA、DNA成分，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。其中，外泌體是研究最廣的一類EVs，其直徑約為30～150 nm，可存在于血液、唾液、尿液和母乳中。

包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞都能釋放外泌體，但其成分在疾病和生理狀態(tài)下存在顯著差異。研究表明，外泌體中部分miRNA與蛋白質(zhì)參與了HCC的發(fā)生、遷移、侵襲，并且在HCC中有特異性的表達(dá)。由于外泌體的膜性結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)內(nèi)含的miRNA、lncRNA免受RNA酶降解，其在體液中的穩(wěn)定存在使外泌體核酸成分較單純的循環(huán)核酸更具有優(yōu)勢(shì)。Cho等[10]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞來源的外泌體miR-10b-5p可作為HCC的早期診斷生物標(biāo)志物(AUROC= 0.934；靈敏度90.7%，特異度75.0%)。除miRNA外，研究較多的外泌體環(huán)狀RNA(circRNA)也可作為診斷標(biāo)志物。例如，Wei等[11]報(bào)道了circRNA_101237的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，具有作為HCC診斷標(biāo)志物的潛力。

四、循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或者因診療操作自腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移性病灶脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞。對(duì)CTCs進(jìn)行測(cè)序能夠反映參與HCC上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移及治療后的復(fù)發(fā)等進(jìn)程的相關(guān)差異基因，并且能夠較好地反映腫瘤在患者體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，在HCC的早期診斷中具有一定意義[12]。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，CTCs的檢測(cè)也越來越方便，在HCC 其他腫瘤的早期個(gè)性化診斷中有十分廣闊的應(yīng)用前景。需要注意的是，不同腫瘤患者之間、同一患者不同腫瘤部位，甚至同一腫瘤不同腫瘤細(xì)胞之間均存在明顯的異質(zhì)性。

五、挑戰(zhàn)與展望

近年來的多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)了液體活檢在HCC診斷中極具潛力的應(yīng)用價(jià)值。相較于AFP、DCP等傳統(tǒng)的HCC無創(chuàng)篩查指標(biāo)，基于血漿cfDNA、RNA及細(xì)胞外囊泡等成分的液體活檢方法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢(shì)，能夠在HCC疾病早期予以檢出。但是，需要注意的是，盡管循環(huán)血中的cfDNA上的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)改變能夠較靈敏、特異地診斷HCC，但研究人員仍需警惕診斷過程中假陽性事件的發(fā)生。一個(gè)可能的原因是由于慢性肝炎(如HBV、HCV)或肝硬化患者的cfDNA中也可能存在HCC相關(guān)突變或病毒基因整合事件，即部分驅(qū)動(dòng)突變?cè)贖CC發(fā)生前已存在；而在健康人群中，循環(huán)cfDNA中的JAK2、TP53、KRAS突變可來源于造血細(xì)胞[13]，從而增加了假陽性事件的發(fā)生。臨床醫(yī)生在利用cfDNA突變進(jìn)行腫瘤診斷時(shí)，或需同時(shí)對(duì)配對(duì)的外周血細(xì)胞進(jìn)行基因分型以排除來源于造血細(xì)胞的突變，或者結(jié)合HCC特異性突變(CTNNB1、AXIN1等)輔助診斷，避免誤診。

慢性乙型肝炎、肝硬化患者是HCC的高危人群，對(duì)這類患者的篩查進(jìn)行定期HCC篩查監(jiān)測(cè)，有助于HCC的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療，具有較高的效益成本比，同時(shí)也是提高肝癌療效的關(guān)鍵[1]。如HCCscreen用于HBsAg(+)的無癥狀社區(qū)人群的HCC篩查可檢出AFP和CT難以診斷的早期HCC患者。最近的一項(xiàng)國際多中心的研究顯示[14]，基于患者年齡、性別及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)白蛋白、膽紅素測(cè)定和血小板計(jì)數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型“aMAP”，可以將不同病因的慢性肝病患者進(jìn)一步劃分為肝癌低危和高危人群。這種對(duì)高危人群的精細(xì)界定可能有助于進(jìn)一步提高液體活檢陽性預(yù)測(cè)值過低的問題。

目前，液體活檢從樣本采集、處理、質(zhì)量控制到數(shù)據(jù)分析的各個(gè)過程仍有待進(jìn)一步簡(jiǎn)化、規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化，如外泌體、cfDNA等提純方法需要統(tǒng)一。此外，如何在不影響CTCs特性的情況下予以分離同樣是亟待解決的問題。

近年來隨著對(duì)這類診斷方法研究的不斷深入，其診斷成本也在逐漸下降。希望在不久的將來，液體活檢技術(shù)能夠成功運(yùn)用到臨床HCC的早期診斷中，使患者得到及時(shí)治療，從而改善預(yù)后。