耐藥結節(jié)細胞分化超家族介導鮑曼不動桿菌替加環(huán)素耐藥機制研究

張心宇， 杜雪飛， 鄒桂玲， 姜曉峰

（哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150001）

鮑曼不動桿菌是一種常見的可引起醫(yī)院感染的條件致病菌，隨著抗菌藥物的廣泛使用，越來越多的多重耐藥鮑曼不動桿菌（multidrugresistant Acinetobacter baumannii，MDR-AB）被發(fā)現(xiàn)[1-3]。替加環(huán)素是目前治療MDR-AB和碳青霉稀類耐藥鮑曼不動桿菌的少數(shù)可選藥物之一。目前，我國已有替加環(huán)素不敏感或耐藥鮑曼不動桿菌的相關報道[1-3]，但鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥機制十分復雜，至今尚未被完全闡明。有研究結果顯示，鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥機制與耐藥結節(jié)細胞分化超家族（resistance nodulation division，RND）外排泵高表達有關[4-8]，但這一結論并不適用于所有菌株[5-6，9-10]，目前關于鮑曼不動桿菌耐藥的研究多集中于我國南方地區(qū)，東北地區(qū)目前尚無相關報道。本研究旨在了解哈爾濱地區(qū)RND外排泵介導MDR-AB替加環(huán)素敏感性降低的相關機制，探討鮑曼不動桿菌替加環(huán)素耐藥與RND外排泵基因表達的關系，進一步明確鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素耐藥的可能機制，以指導臨床合理用藥。

1 材料和方法

1.1 菌株篩選

收集2015年11月—2018年2月分離自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院患者的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL的鮑曼不動桿菌21株。同時隨機選取同一時期替加環(huán)素MIC≤2 μg/mL的MDRAB 39株。質控菌株為銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）和鮑曼不動桿菌（ATCC 19606），均購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司），基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（德國布魯克公司），TC-96/G/H（b）bioer基因擴增儀（杭州博日公司），LightCycler480Ⅱ高通量實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），BIORAD通用基礎電泳儀（美國伯樂公司），Ultra PowerTM可見光透射儀（北京百泰克公司）。替加環(huán)素藥物敏感性試驗試劑（溫州生物公司），哥倫比亞瓊脂、MH瓊脂（鄭州安圖生物工程股份有限公司），Taq PCR Master Mix（2×with Blue Dye）、DNA Marker D（100～2 000 bp）、LB Broth-ready to us、Trizol試劑、RNA-E2 Reagents N DNA-Be-GoneA、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司]，Biowest Agarose（西班牙Biowest公司），AceQ qPCR SYBR Green Mastermix（南京Vazyme公司）。根據文獻[16-18]確定引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列見表 1。

1.3 體外藥物敏感性試驗

采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀檢測β內酰胺類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物及替加環(huán)素的MIC。對替加環(huán)素MIC≥4 μg/mL的菌株分別采用紙片擴散法及微量肉湯稀釋法檢測其對替加環(huán)素的敏感性。紙片擴散法、微量肉湯稀釋法替加環(huán)素敏感性折點參考2014年歐洲藥物敏感性試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）標準，其他抗菌藥物敏感性折點參照2017年美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S27文件。以微量肉湯稀釋法為標準方法，以替加環(huán)素非敏感菌株（MIC≥2 μg/mL）為實驗組，替加環(huán)素敏感菌株（MIC≤1 μg/mL）為對照組。

1.4 RND外排泵基因檢測

采用煮沸法提取菌株的模版DNA，檢測adeB、adeG、adeJ、adeS、baeR和baeS基因。反應體系：Taq PCR Master Mix（2×with Blue Dye）10 μL，上、下游引物各5 μmol/L，模版DNA濃度為40～100 ng，雙蒸水補充體系至20 μL。反應條件： 預變性 95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 1 min，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）產物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，觀察結果。

表1 RND外排泵操縱子及內參基因引物序列

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）檢測外排泵表達量

采用Trizol法提取鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）標準菌株及對照組、實驗組菌株對數(shù)生長期細菌總RNA。每10 μL反轉錄體系利用1 g總RNA合成第1鏈cDNA，反應條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。采用RT-qPCR檢測外排泵adeB、adeG、adeJ、adeR、baeR和baeS轉錄水平，采用LightCycler480Ⅱ高通量實時熒光定量PCR儀配套軟件分析得到各個樣本管家基因gyrB和Ct值，以管家基因gyrB為內參，MDR-AB標準菌株鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）為參考菌株，采用2-ΔΔCT法計算各外排泵基因的相對表達量。

1.6 雙組分調節(jié)系統(tǒng)基因插入序列檢測

對于外排泵基因adeB表達水平升高的菌株，采用PCR對其adeS基因進行擴增，產物送生工生物工程（上海）有限公司進行測序，通過ISFinder數(shù)據庫比對查找插入序列。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據采用GraphPad Prism 5軟件進行分析。

2 結果

2.1 藥物敏感性試驗結果

采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀共鑒定出替加環(huán)素非敏感鮑曼不動桿菌21株，采用紙片擴散法抗菌藥物敏感性試驗篩選出替加環(huán)素抑菌圈直徑≤12 mm的菌株10株，采用微量肉湯稀釋法篩選出替加環(huán)素MIC≥2 μg/mL的菌株12株，并且這些菌株對亞胺培南亦耐藥。VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀分析的MIC值與微量肉湯稀釋法相比，高2～4個稀釋度。實驗組鮑曼不動桿菌藥物敏感性試驗結果見表2。

2.2 RND外排泵基因檢測結果

實驗組、對照組所有菌株均檢出RND相關外排泵基因adeB、adeG、adeJ、adeS、baeR和baeS，檢出率為100%。

2.3 RND外排泵轉錄水平表達量檢測結果

實驗組adeB表達水平在不同菌株之間存在差異，替加環(huán)素非敏感菌株TR5、TR13和TR20 adeB的表達水平分別約是替加環(huán)素參考菌株鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）的3.3、3.5和2.7倍。adeG相對表達水平在菌株TR7中稍有升高，約是參考菌株鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）的2.8倍。adeJ、adeR、baeR以及baeS表達水平在菌株中未見明顯升高。見圖1。

12株替加環(huán)素非敏感菌株adeB、adeG、adeJ、adeR、baeR及baeS的相對表達量分別為1.43±0.32、1.107±0.20、0.86±0.10、0.84±0.14、0.13±0.03和1.12±0.10；48株替加環(huán)素敏感菌株adeB、adeG、adeJ、adeR、baeR及baeS的相對表達量分別為1.12±0.12、0.48±0.06、0.66±0.06、 0.66±0.09、0.10±0.01和1.53±1.11。見圖2。

表2 實驗組鮑曼不動桿菌藥物敏感性試驗結果

圖1 實驗組RND外排泵相對表達量

2.4 adeS突變檢測

外排泵表達水平增高與上游雙組分調節(jié)系統(tǒng)adeS序列插入有關，在外排泵高表達替加環(huán)素非敏感菌株TR5及TR13的adeS基因中發(fā)現(xiàn)了ISAbaⅠ插入序列。在菌株TR5中發(fā)現(xiàn)的ISAbaⅠ插入序列。部分測序結果見圖3。

圖2 實驗組及對照組RND外排泵相對表達量

圖3 TR5菌株adeS基因插入序列ISAbal部分測序結果

3 討論

替加環(huán)素是目前治療MDR-AB和碳青霉稀類抗菌藥物耐藥鮑曼不動桿菌的少數(shù)可選藥物之一，抗菌譜廣、抗菌活性強、不良反應小，且應用不受患者年齡、性別、病情等的限制。自2005年美國食品藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準替加環(huán)素應用于臨床治療后，僅1年就分離到了替加環(huán)素敏感性降低的鮑曼不動桿菌。目前，我國也檢出了替加環(huán)素不敏感或耐藥的鮑曼不動桿菌，然而替加環(huán)素的耐藥機制仍不明確。

目前，臨床實驗室多以VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性，但在實際工作中發(fā)現(xiàn)VITEK 2 Compact全自動細胞鑒定儀的鑒定結果較微量肉湯稀釋法MIC值高2～4個稀釋度，“假中介”及“假耐藥率”較高，因此VITEK 2 Compact全自動細胞鑒定儀能否作為鮑曼不動桿菌替加環(huán)素敏感性檢測的方法仍有待商榷。臨床上檢測替加環(huán)素抑菌活性的方法很多，培養(yǎng)基配制時間、錳的含量、易氧化等因素往往會使結果的準確性受到影響[14]。《替加環(huán)素體外藥敏試驗操作規(guī)程專家共識》推薦以肉湯稀釋法作為金標準，建議當VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀確定鮑曼不動桿菌替加環(huán)素中介或耐藥時，應用微量肉湯稀釋法進行確證[15]。

作為RND的3種外排泵，AdeABC，AdeFGH和AdeIJK與該物種的替加環(huán)素耐藥性有關，由膜融合蛋白（membrane fusion protein，MFP）、膜轉運蛋白和外膜因子（outer membrane protein，OMF）3種蛋白質共同發(fā)揮作用。雙組分調節(jié)系統(tǒng)AdeRS與BaeRS位于AdeABC上游，可感應外界環(huán)境并在保守組氨酸殘基發(fā)生自磷酸化，通過轉移磷酸基團并調控DNA 的轉錄，調節(jié)下游基因表達[16]。本研究結果顯示，adeB、adeG、adeJ、adeS和baeRS基因在所有的實驗組和對照組菌株中都被檢測到，驗證了外排泵基因很可能是鮑曼不動桿菌的固有基因這一觀點，即當菌株暴露在外排泵底物環(huán)境中時，外排泵基因表達水平會上調，從而使菌株耐藥[17]。

通過RT-qPCR驗證發(fā)現(xiàn)實驗組菌株TR5、TR13和TR20的adeB表達水平上調。同時在TR5和TR13的adeS中發(fā)現(xiàn)ISAbaⅠ序列插入，已知機制表明ISAbaⅠ插入adeS會產生1個N末端截短的adeS和由ISAba1 Pout啟動子產生的mRNA轉錄本。這種截短的adeS能夠激活adeR，并增強adeABC基因表達[18]。SUN等[18]和HAMMERSTROM等[19]的研究結果與本研究結果一致。除AdeRS以外，雙組分調節(jié)系統(tǒng)BaeRS可正向調控adeB的表達[12，20]，TR20中僅adeB表達量增加，該結果的出現(xiàn)不排除RND外排泵僅作為鮑曼不動桿菌替加環(huán)素敏感性降低的輔助因素。目前認為低劑量抗菌藥物治療會使AdeFGH外排泵過度表達，增加誘導生物膜形成的自誘導分子的合成和轉運[21-23]；另外，某些藥物，如去甲腎上腺素也會導致AdeFGH的過表達，誘導生物膜形成[8]。由于本研究未進行多位點序列分子分型研究，所以無法說明去甲腎上腺素具體如何誘導adeG表達水平升高以及是否存在其他非抗菌藥物類藥物影響鮑曼不動桿菌的抗菌活性，這也是我們下一步研究的重點。

值得注意的是，雖然本研究中外排泵基因的檢出率為100%，但僅有少數(shù)菌株的外排泵基因水平表達上調，且表達水平上調的幅度并不高。這一結果表明，RND外排泵基因高表達很可能不是鮑曼不動桿菌替加環(huán)素敏感性下降的唯一因素。有研究發(fā)現(xiàn)，外排泵在細菌耐藥過程中主要介導低水平耐藥，只作為一種耐藥背景參與替加環(huán)素耐藥的發(fā)生[17]。因此，我們推測RND外排泵可能僅輔助其他耐藥機制促進替加環(huán)素耐藥發(fā)生，而這一假設還有待進一步研究確證。