NKX2-5在乳腺癌患者他莫昔芬耐藥中的作用及調(diào)控機(jī)制

趙 錚， 李 毅， 楊飛翔

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，每年發(fā)病率占女性惡性腫瘤的29%[1]。內(nèi)分泌治療是雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌最有效的治療手段。有研究結(jié)果顯示，內(nèi)分泌治療可降低ER陽性乳腺癌患者的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)，提高生存率[2]。內(nèi)分泌治療藥物的耐藥會(huì)使乳腺癌治療難度增加。有調(diào)查結(jié)果顯示，約有25%的ER陽性乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬（tamoxifen，TAM）初始治療無效，即使在首次TAM治療有效的患者中，也有40%最終可能會(huì)發(fā)展成獲得性耐藥[3]。因此，探討TAM的耐藥機(jī)制對(duì)乳腺癌臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。轉(zhuǎn)錄因子NKX2-5是NK同源盒-2基因的成員，主要表達(dá)于心臟組織，維持心臟的正常發(fā)育和功能[4]。近來年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分惡性腫瘤中NKX2-5表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，如前列腺癌等實(shí)體瘤中NKX2-5表達(dá)下調(diào)，并與患者不良結(jié)局呈負(fù)相關(guān)[5]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路在乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物耐藥機(jī)制中扮演著重要角色。有研究結(jié)果顯示，阻斷MAPK信號(hào)通路可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，而激活該信號(hào)通路會(huì)增強(qiáng)ER轉(zhuǎn)錄效率并導(dǎo)致TAM耐藥[6]。本研究擬分析NKX2-5是否能通過阻斷MAPK信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)TAM耐藥。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年7月—2016年7月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院采用規(guī)律內(nèi)分泌藥物（TAM 20 mg/d）治療的乳腺癌患者50例，年齡23～73歲。收集所有患者TAM治療前切除的乳腺癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理檢查證實(shí)為乳腺癌，入院前未接受過放療、化療、激素治療或其他抗癌治療。排除合并其他惡性腫瘤者。50例患者中有18例（36.0%）發(fā)生TAM耐藥，再次收集TAM耐藥患者的組織樣本。組織樣本取出后立即置于液氮中保存。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者治療前均簽署知情同意書。

1.2 數(shù)據(jù)庫分析

從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）下載乳腺癌患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)（GSE42568），通過整理數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)，分析患者總生存率、無復(fù)發(fā)生存率與腫瘤組織基因表達(dá)水平的關(guān)系。

1.3 細(xì)胞株來源

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3及正常乳腺細(xì)胞株MCF10A均購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。所有細(xì)胞均接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific公司）中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按LI等[7]報(bào)道的方法構(gòu)建TAM耐藥MCF-7細(xì)胞株（MCF-7/TAM）：將TAM溶于甲醇中，配置成終濃度為50 mg/mL的溶液，MCF-7細(xì)胞用含1 μmol/L TAM的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月。后續(xù)為了維持細(xì)胞對(duì)TAM的耐藥表型，將細(xì)胞培養(yǎng)于含0.5 μmol /L TAM的培養(yǎng)基中。

1.4 主要試劑

TAM（美國Sigma公司），NKX2-5抗體（武漢博士德生物工程公司），生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgM抗體（二抗）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），兔抗人細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylatedextracellular regulated protein kinase，p-ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated-p38 mitogenactivated protein kinase，p-p38MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化c-Jun氨基末商激酶（phosphorylatedc-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）。

1.5 癌組織和癌旁組織樣本中NKX2-5的表達(dá)

所有組織樣本均用中性甲醛固定，石蠟包埋后制成厚度為3 μm的切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。加入0.1%過氧化氫，室溫孵育15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，5%羊血清封閉10 min。滴加NKX2-5抗體，4 ℃孵育過夜，再滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，中性樹膠封固，CX41型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）下觀察。根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度，采用半定量評(píng)分法對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。染色強(qiáng)度：無染色記0分，輕度染色記1分，中度染色記2分，重度染色記3分。陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞百分比＜10%記1分，陽性細(xì)胞百分比為10%～50%記2分，陽性細(xì)胞百分比＞50%記3分。最終評(píng)分為染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞百分比得分。

1.6 NKX2-5過表達(dá)和抑制

NKX2-5過表達(dá)質(zhì)粒（Ad-NKX2-5）、空載質(zhì)粒（Ad-NC）及NKX2-5小干擾RNA質(zhì)粒（NKX2-5-siRNA）、空白對(duì)照（NC-siRNA）由上海吉瑪生物制藥有限公司合成。NKX2-5-siRNA序列為：5'-GCAGCUUCACCUAUCCGAU-3'，NC-siRNA序列為3'-CGUCGAAGUGGAUAGGCUA-5'。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將Ad-NKX2-5、Ad-NC轉(zhuǎn)染MCF-7/TAM細(xì)胞（Ad-NKX2-5組、Ad-NC組），將NKX2-5-siRNA、NC-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞（NKX2-5-siRNA組、NC-siRNA組）。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒和低表達(dá)質(zhì)粒，具體步驟：將細(xì)胞接種于6孔板，加入200 μL Lipofectamine 2000和4 μg質(zhì)粒，室溫避光孵育20 min，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的蛋白表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.7 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.0×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板（100 μL/孔），分別用5、20、50、100 μmol/L TAM處理，連續(xù)培養(yǎng)72 h，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各孔的吸光度（A）值，計(jì)算并繪制細(xì)胞在不同濃度TAM下的增殖抑制曲線，各組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值。增殖抑制率=（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。

1.8 乳腺癌細(xì)胞中各種蛋白的表達(dá)

收集Ad-NKX2-5組、Ad-NC組、NKX2-5-siRNA組和NC-siRNA組細(xì)胞，加入1 mL RIPA裂解液，冰浴上裂解20 min，4 ℃ 16 110×g離心15 min，吸取上清液，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白純度。取50 μg總蛋白，用10%十二磺基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離。分別加入NKX2-5抗體（1∶1 000）、ERK抗體（1∶1 000）、p-ERK抗體（1∶1 000）、P38抗體（1∶1 000）、p-P38抗體（1∶1 000）、JNK抗體（1∶1 000）、p-JNK抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。次日用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3遍，滴加二抗稀釋液（1∶4 000），37 ℃孵育2 h。加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）液顯色，采用LAS4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3、MCF10A中NKX2-5 mRNA的表達(dá)及正常乳腺細(xì)胞株

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3、MCF10A細(xì)胞中NKX2-5 mRNA的表達(dá)。采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒將0.5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。取1 μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（ploymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。NKX2-5：5'-CGGACCACCTCGCCTTACA-3'（正義鏈），5'-CTGGGCTCCTTCCCTCATCG-3'（反義鏈）；GAPDH：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'（正義鏈），5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'（反義鏈）。反應(yīng)條件：95 ℃45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織樣本中NKX2-5的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，NKX2-5主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞顏色為棕黃色或褐色。癌旁組織NKX2-5的陽性表達(dá)率為74.0%（37/50），癌組織為42.0%（21/50），癌旁組織NKX2-5表達(dá)明顯高于癌組織（P＜0.05）。TAM敏感組織中NKX2-5表達(dá)明顯高于TAM耐藥組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同組織中NKX2-5的表達(dá)（×200）

表1 乳腺癌患者的一般資料

本研究50例乳腺癌患者和GEO數(shù)據(jù)庫104例乳腺癌患者的臨床資料見表1。

癌旁組織NKX2-5的評(píng)分明顯高于乳腺癌組織（P＜0.000 1）。TAM敏感組織NKX2-5的評(píng)分明顯高于TAM耐藥組織（P＜0.000 1）。見圖2。

NKX2-5高表達(dá)率為78.8%（82/104），NKX2-5低表達(dá)率為21.2%（22/104）。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，NKX2-5低表達(dá)組總生存率和無復(fù)發(fā)生存率明顯低于NKX2-5高表達(dá)組（P＜0.000 1）。在接受TAM治療的乳腺癌患者中，NKX2-5低表達(dá)組總生存率明顯低于NKX2-5高表達(dá)組（P＜0.000 1）。見圖3。

圖2 不同組織免疫組化染色評(píng)分比較

圖3 NKX2-5高表達(dá)和低表達(dá)乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、BCAP37、T47D、SKBR3及正常乳腺細(xì)胞株MCF10A中NKX2-5的表達(dá)

與MCF10A細(xì)胞相比，MCF-7細(xì)胞NKX2-5 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，T47D、BCAP37、SKBR3細(xì)胞明顯降低（P＜0.05），見圖4。采用不同濃度TAM處理MCF-7、T47D、BCAP37及SKBR3細(xì)胞，結(jié)果顯示TAM對(duì)MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibit concentration，IC50）低于T47D、BCAP37及SKBR3細(xì)胞，見表2。

由于MCF-7細(xì)胞NKX2-5的表達(dá)量相對(duì)較高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象。與MCF-7細(xì)胞比較，MCF-7/TAM細(xì)胞NKX2-5蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖5。

圖4 MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3及MCF10A細(xì)胞NKX2-5蛋白及NKX2-5 mRNA的表達(dá)

表2 不同濃度TAM對(duì)MCF-7、T47D、BCAP37、SKBR3細(xì)胞的增殖抑制率 %，x±s

圖5 MCF-7和MCF-7/TAM細(xì)胞NKX2-5蛋白表達(dá)的比較

TAM對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50低于MCF-7/TAM細(xì)胞，見表2。MCF-7和MCF-7/TAM細(xì)胞的NKX2-5蛋白表達(dá)均呈濃度依賴性降低，見圖6。

2.3 NKX2-5表達(dá)對(duì)TAM敏感性的影響

Ad-NKX2-5組NKX2-5蛋白表達(dá)明顯高于Ad-NC組（P＜0.05），NKX2-5-siRNA組蛋白NKX2-5蛋白表達(dá)明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05），見圖7。提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

圖6 不同濃度TAM處理后MCF-7和MCF-7/TAM細(xì)胞NKX2-5蛋白表達(dá)的比較

采用50、100 μmol/L TAM處理后，Ad-NKX2-5組增殖抑制率明顯高于Ad-NC組（P＜0.05），NKX2-5-siRNA組增殖抑制率明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05）。見表3。

2.4 NKX2-5對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響

MCF-7/TAM細(xì)胞p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表達(dá)明顯高于MCF-7細(xì)胞（P＜0.05），見圖8。

Ad-NKX2-5組p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表達(dá)明顯低于Ad-NC組（P＜0.05），NKX2-5-siRNA組p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表達(dá)明顯高于NC-siRNA組（P＜0.05）。見圖9。

圖7 Ad-NKX2-5組、Ad-NC組、NKX2-5-siRNA組和NC-siRNA組NKX2-5蛋白的表達(dá)

表3 不同濃度TAM對(duì)Ad-NKX2-5組、Ad-NC組和NKX2-5-siRNA組、NC-siRNA組的增殖抑制率%，

表3 不同濃度TAM對(duì)Ad-NKX2-5組、Ad-NC組和NKX2-5-siRNA組、NC-siRNA組的增殖抑制率%，

注：與Ad-NC組比較，*P＜0.05；與NC-siRNA組比較，#P＜0.05

images/BZ_59_197_1072_1117_1204.pngAd-NKX2-5組 8.7±0.521.4±5.7 56.9±10.1*67.9±7.8*Ad-NC組 4.3±0.419.7±4.5 28.9±7.3 49.7±7.1 NKX2-5-siRNA組19.8±5.438.9±6.2*#40.9±5.4*# 40.5±5.6*#NC-siRNA組 21.2±6.559.4±8.4 60.1±8.9 67.7±7.6

圖8 MCF-7細(xì)胞和MCF-7/TAM細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖9 Ad-NKX2-5組、Ad-NC組、NKX2-5-siRNA組和NC-siRNA組MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

內(nèi)分泌治療藥物耐藥是ER陽性乳腺癌患者臨床治療的難點(diǎn)之一，耐藥的產(chǎn)生會(huì)影響內(nèi)分泌治療的效果和患者的遠(yuǎn)期生存率[8]。本研究分析了從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取的相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示NKX2-5低表達(dá)組總生存率和無復(fù)發(fā)生存率明顯低于NKX2-5高表達(dá)組，在接受內(nèi)分泌藥物治療的乳腺癌患者中，NKX2-5低表達(dá)與總生存率有關(guān)，提示NKX2-5可能是乳腺癌的一種抑癌基因，或可作為乳腺癌預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)之一。同時(shí)，本研究臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，乳腺癌組織NKX2-5表達(dá)降低，TAM耐藥患者的癌組織中NKX2-5表達(dá)也同樣降低，提示NKX2-5可能與乳腺癌TAM耐藥有關(guān)。

既往研究結(jié)果顯示，NKX2-5與心肌細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)[9-10]。NKX2-5可激活α-肌動(dòng)蛋白等心肌轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎時(shí)期心肌組織定向分化過程中起關(guān)鍵作用[11]。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織NKX2-5表達(dá)下調(diào)，NKX2-5可能通過表觀遺傳DNA甲基化改變抑制前列腺癌的早期病變[12]。還有研究結(jié)果顯示，肺癌血清NKX2-5水平明顯升高，NKX2-5高表達(dá)與患者的不良結(jié)局有關(guān)[13]。這說明NKX2-5表達(dá)可能存在組織特異性，在不同腫瘤中發(fā)揮的作用也不一樣。目前，尚未見NKX2-5與惡性腫瘤化療耐藥的相關(guān)報(bào)道。楊莉[14]的研究結(jié)果顯示，NKX2-5的同型家族成員NKX2-1與肺癌化療藥物的耐藥有關(guān)，NKX2-1高表達(dá)的肺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性高于順鉑及多西他賽。本研究結(jié)果顯示，TAM對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50明顯低于MCF-7/TAM細(xì)胞，且MCF-7/TAM細(xì)胞NKX2-5蛋白表達(dá)明顯低于MCF-7細(xì)胞。提示NKX2-5可能參與了乳腺癌細(xì)胞TAM耐藥的發(fā)生。

本研究采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)MCF-7/TAM細(xì)胞和下調(diào)MCF-7細(xì)胞中NKX2-5的表達(dá)，結(jié)果顯示，上調(diào)MCF-7/TAM細(xì)胞NKX2-5表達(dá)可以明顯增強(qiáng)TAM對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用，而下調(diào)MCF-7細(xì)胞NKX2-5表達(dá)則可降低MCF-7細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性。說明NKX2-5可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM的耐藥性。ALCáNTARA-ORTIGOZA等[15]分析了癌癥基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)肺癌、乳腺癌等組織中缺乏NKX2-5；敲除NKX2-5基因后可激活SOX2和KRAS 2種癌基因，誘導(dǎo)組織出現(xiàn)惡性病變，并介導(dǎo)癌細(xì)胞逃避化療和藥物治療。LI等[16]的研究結(jié)果顯示，TAM可以上調(diào)NKX2-1表達(dá)，在TAM耐藥的細(xì)胞株中上調(diào)NKX2-1可以增加細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性。本研究初步證實(shí)NKX2-5是一種抑癌因子，并可增加TAM耐藥乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性。

內(nèi)分泌治療藥物耐藥的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，有多種信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制參與其中。ERK、JNK和p38MAPK信號(hào)通路是生物體內(nèi)存在的一條經(jīng)典信號(hào)通路[17]。MAPK通路可將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，并引起細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)反應(yīng)[18]。XU等[19]的研究結(jié)果顯示，阻斷MAPK信號(hào)通路可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，激活此信號(hào)通路則可降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性。既往研究證實(shí)TAM耐藥乳腺癌細(xì)胞中活化型ERK明顯增加，p-P38MAPK表達(dá)增加與MCF-7細(xì)胞TAM耐藥有關(guān)[20-21]。本研究結(jié)果顯示，與MCF-7細(xì)胞比較，MCF-7/TAM細(xì)胞p38MAPK、JNK、ERK的活化型蛋白（p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK）表達(dá)明顯增加，提示TAM耐藥細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，TAM耐藥可能與MAPK信號(hào)通路活化有關(guān)。上調(diào)MCF-7/TAM細(xì)胞NKX2-5表達(dá)可以抑制MAPK通路，而下調(diào)MCF-7細(xì)胞NKX2-5表達(dá)則可激活MAPK通路，提示NKX2-5可能是通過抑制MAPK信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞對(duì)TAM的耐藥。

綜上所述，TAM耐藥乳腺癌細(xì)胞中NKX2-5表達(dá)下調(diào)。上調(diào)NKX2-5表達(dá)或許能通過抑制MAPK信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞對(duì)TAM的耐藥。NKX2-5有望成為TAM耐藥乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。