隔藥餅灸對慢性支氣管炎模型大鼠外周血中T細胞亞群的影響?

羅 明，陽仁達，譚 靜，李雙艷，言 芳，孫 璐，蘭 偉

(湖南中醫(yī)藥大學研究生院，長沙 410208)

慢性支氣管炎(chronic bronchitis CB)簡稱慢支，是氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床以咳嗽、咳痰為主或伴有喘息，是呼吸系統(tǒng)常見疾病，中老年人發(fā)病較高[1]。慢支的治療西醫(yī)以抗感染及止咳平喘為主[2]，中醫(yī)則根據(jù)辨證或以湯藥內(nèi)服或以針灸外用[3]。研究表明[4-5]，慢支的發(fā)生發(fā)展與機體免疫密切相關。一方面，免疫功能的減退為炎癥的產(chǎn)生提供了便利條件；另一方面，在炎癥狀態(tài)下，免疫失衡將進一步促進炎癥的發(fā)展。針灸作為中醫(yī)療法的重要組成部分，幾千年來為民生健康做出了重要貢獻。隔藥餅灸作為針灸療法的一種，臨床運用較為廣泛[6]。本課題的前期研究表明，隔藥餅灸能增加慢支大鼠外周血中免疫球蛋白的含量[7]，但是否對外周血中T淋巴細胞亞群有影響尚不明確。本研究通過觀察隔藥餅灸對慢支模型大鼠外周血中T細胞亞群含量的影響，進一步探討隔藥餅灸治療慢支的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康SPF級SD大鼠48只，體質(zhì)量200～250 g，隨機分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、核酪口服液4組各12只，雌雄各半。上述動物由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(動物合格證編號SCXK(湘)2017-0003)，分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50%～70%(動物飼養(yǎng)環(huán)境實驗室合格證號SCXK<湘>2009-0001)。

1.2 主要試劑及儀器

戊巴比妥鈉(Biotobbed)；淋巴細胞分離液(華美生物)；紅細胞溶解液(華美生物)；大鼠CD3-APC(eBioscience)、CD4-PE(eBioscience)、CD8a-PE-Cyanine 7(eBioscience)、單抗(Sigma)；流式細胞儀(LSRII型，美國Becton Dickinson)；低速離心機(LD5-10B型，北京京立)；“神灸300灸”艾炷(型號：東方1型)。

1.3 模型制備方法

參考有關文獻[8]采用改良煙熏法復制慢支大鼠模型。造模時將大鼠置于特制的1×1×1 m的煙室中，刨花、鋸末、煙葉各50 g點燃熏煙，每日2次，每次30 min，持續(xù)30 d。模型成功的標志為大鼠厭食、咳嗽、氣喘、呼吸困難、蜷縮少動、精神萎頓、瘦弱、體毛枯槁、行動遲緩等。另顯微鏡下可見，大鼠氣管黏膜上皮細胞增生，纖毛數(shù)目減少，纖毛變短，氣管黏膜的纖毛倒伏、脫落，支氣管壁炎細胞浸潤，支氣管平滑肌增厚、斷裂。

1.4 隔藥餅灸干預方法

選穴：Ⅰ組：肺俞、腎俞；Ⅱ組：關元、足三里。定位參照十二五規(guī)劃教材《實驗針灸學》[9]。

玉屏風散藥餅制作：黃芪、白術(炒)、防風按2∶2∶1的比例稱取，所用中藥材由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供。上述諸藥烘干、粉碎后過200目篩，裝瓶備用。使用時將藥粉用生姜汁調(diào)和成糊狀(藥粉和姜汁的比例約為10∶7)，制成厚約2～4 mm、直徑為1±0.2 cm的藥餅。

施灸操作：于造模后的第1天先用100 g/L硫化鈉對大鼠施灸部位進行脫毛。選定穴位后，將藥餅敷于穴位皮膚并用膠布固定，然后將去除隔熱紙墊的艾柱放于藥餅上點燃施灸，待艾炷燃完且余熱散盡再換另一壯，每穴連續(xù)灸6壯(20 min)，每日1次，Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，連續(xù)治療2周。在隔藥餅灸組干預過程中，其余組大鼠予以捆綁束縛于鼠板上。

1.5 給藥方法

于造模結(jié)束后第1天起稱取大鼠體質(zhì)量，核酪口服液組按照0.2 ml/10 g給予核酪口服液灌胃，每日1次，連續(xù)2周。空白組、模型組和隔藥餅灸組同時灌以生理鹽水，其劑量、次數(shù)、天數(shù)與核酪口服液組相同。

1.6 取材及指標觀察

實驗期間，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)如體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)等。待治療結(jié)束，禁食不禁水12 h后摘取眼球，眼眶采血2 ml 加入抗凝管中用于流式檢測。

1.6.1 氣管、肺組織病理切片觀察 采血后處死大鼠，剖取4組大鼠氣管和右肺組織，置于4%的甲醛溶液中固定24 h，按照85%乙醇-95%乙醇-無水乙醇的梯度進行脫水，脫水后石蠟包埋，4～5 μm標準進行切片，HE染色，于光鏡下觀察各組大鼠氣管及肺組織的病理學變化。

1.6.2 外周血T細胞亞群含量測定 檢測時，取24 h內(nèi)外周抗凝血100 μl 加入流式管底部；分別加入FITC標記CD8單抗和PE標記CD4單抗，室溫避光15 min。加入紅細胞裂解液，混勻后避光10～15 min，1000 r/min離心5 min棄上清液。加入PBS液500 μl清洗2次，1000 r/min離心5 min棄上清液。加入PBS液500 μl重懸細胞，流式細胞儀檢測，通過FACS Diva6.0分析軟件獲取分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

圖1顯示，通過生存狀態(tài)積分評定來評價造模后各組大鼠生存狀況。5分：正常大鼠飲食如常，無咳嗽、氣喘、呼吸困難，活動自如，反應靈敏，體毛光滑順澤；4分：大鼠出現(xiàn)食量稍減少，咳嗽，無氣喘，無呼吸困難，反應稍遲鈍，體毛欠光滑順澤；3分：大鼠食量減少，咳嗽、氣喘、無呼吸困難，反應遲鈍，體毛豎立；2分：大鼠食量劇減，咳嗽、氣喘、輕度呼吸困難，瘦弱，毛枯，行動遲緩；1分：大鼠極度厭食，咳嗽、氣喘、中度呼吸困難，蜷縮少動，精神萎頓，體毛枯槁；0分：大鼠死亡。成模后開始干預，各組大鼠生存狀態(tài)計分。

圖1 各組大鼠生存狀態(tài)積分比較

圖1顯示，在觀察時間內(nèi)各組均未見大鼠死亡。成模后，模型組、隔藥餅灸組、核酪口服液組的生存狀態(tài)積分均下降；與空白組比較，模型組自成模后生存狀態(tài)積分一直波動在1～2分之間，差異顯著(P<0.01)；干預9 d后，隔藥餅灸組、核酪口服液組生存狀態(tài)積分明顯高于模型組(P<0.05)；干預14 d后，與模型組比較，隔藥餅灸組、核酪口服液組生存狀態(tài)積分均顯著增加，同時隔藥餅灸組顯著高于核酪口服液組(P<0.05)。

2.2 氣管和肺組織病理形態(tài)觀察

圖2顯示，正常組大鼠支氣管纖毛排列整齊，無炎性細胞浸潤，支氣管壁平整，支氣管黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞無變性壞死和損傷，肺泡無擴張，無炎癥細胞浸潤。模型組大鼠肺泡擴張，炎癥細胞浸潤，氣管黏膜層及黏膜下層大量炎癥細胞浸潤，管腔內(nèi)有脫落細胞，與空白組比較肺及氣管組炎癥浸潤明顯。隔藥餅灸組大鼠肺內(nèi)支氣管及肺泡正常，散在少量炎癥細胞，氣管黏膜層及黏膜下層正常，少量散在的炎癥細胞提示經(jīng)隔藥餅灸后肺及氣管組織黏膜已修復，炎癥得到基本控制。核酪口服液組大鼠肺泡形態(tài)正常，巨噬細胞增多；氣管黏膜下層有彌漫性淋巴細胞浸潤，管壁完整且無脫落,提示經(jīng)過核酪口服液治療后肺及氣管也正在修復，免疫細胞活躍，對炎癥細胞進行吞噬。

圖2 各組大鼠肺(×100倍)及氣管(×250倍)病理形態(tài)學觀察比較

2.3 各組大鼠外周血中T細胞亞群含量變化比較

表1顯示，各組大鼠外周血中T細胞亞群含量變化比較，與空白組比較，模型組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，隔藥餅灸組、核酪口服液組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+明顯升高(P<0.05)，說明2種治療方法均有升高慢支模型大鼠T細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量的作用；與核酪口服液組比較，隔藥餅灸組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+升高更明顯(P<0.05)。

表1 各組大鼠外周血中T細胞亞群含量變化

注：與空白組比較：★P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與核酪口服液組比較：◆P<0.05

3 討論

T淋巴細胞亞群是免疫系統(tǒng)的重要部分，T淋巴細胞與CD4+、 CD8+分子結(jié)合即產(chǎn)生2種亞群。研究表明[10]，慢支的發(fā)生發(fā)展與T淋巴細胞亞群變化密切相關。CD4+屬于Ig超家族，為細胞膜表面的單鏈糖蛋白，是T淋巴細胞識別、活化與信號傳導的重要免疫因子。其與MHCⅡ類分子非多肽部分結(jié)合，使T細胞抗原受體(TCR)與抗原肽-MHCⅡ類分子間的相互作用趨于穩(wěn)定。另外，其參與細胞內(nèi)信號傳導作用，當CD4+因子含量降低時，炎癥信號不能及時傳與T淋巴細胞，導致T淋巴細胞無以識別炎癥細胞。CD8+同屬Ig超家族，為細胞膜表面的雙鏈糖蛋白，其與MHCⅠ類分子非多肽區(qū)結(jié)合，作用類似CD4+因子[11]。

隔藥餅灸是在直接灸基礎上襯墊以中藥制成的片狀或餅狀物作為傳熱介質(zhì)的一種灸療方法[12]。在合理選擇穴位及藥物后，隔藥餅灸能發(fā)揮 “灸-藥-穴”三位一體的作用。中醫(yī)認為慢支的病位在肺，其根在腎，以虛為主。本研究選取肺俞、腎俞、關元、足三里，其中肺俞、腎俞為肺腎經(jīng)氣輸注于背部的腧穴，可調(diào)節(jié)肺腎功能，與慢支病位相契合。關元自古以來為扶正要穴，研究表明[13]隔藥餅灸關元穴可升高T細胞亞群中CD3+、CD8+細胞和細胞因子，以增強免疫功能。容賢冰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，艾灸關元穴可上調(diào)外周血CD3+、NK、NKT細胞數(shù)量,使CD4+/CD8+比值穩(wěn)定。足三里為保健強壯之要穴，自古以來針灸界頗為重視，其保健防身，提高免疫力的功效在現(xiàn)代基礎研究中得以證實。高義森[15]發(fā)現(xiàn)，電針足三里可重建Th1/Th2平衡，改善由Th1介導的過敏性皮炎癥狀。薛小衛(wèi)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，針刺足三里可降低海馬組織免疫細胞因子IgG1、IgG2a的表達,抑制癲癇發(fā)作,保護腦組織。

本研究藥餅配方源自玉屏風散，該方出自《究原方》，由黃芪、白術、防風3味中藥組成，具有益氣固表、祛風扶正之功，是中醫(yī)扶正固本的經(jīng)典方劑。該方應用廣泛，是國家基本中成藥，被《中華人民共和國藥典》所收載[17]。現(xiàn)代基礎研究表明，玉屏風散可誘導肺氣虛證大鼠淋巴細胞增殖，增強脾臟淋巴細胞活性，提高巨噬細胞活性,激發(fā)NK細胞活性[18]。玉屏風散通過調(diào)節(jié)細胞免疫功能,平衡Th1/Th2淋巴細胞亞群,抑制機體過敏反應，緩解變應性鼻炎大鼠的局部癥狀[19]。加味玉屏風散可降低變應性鼻炎大鼠體內(nèi)免疫球蛋白E，產(chǎn)生抗過敏作用[20]。臨床研究表明，玉屏風散輔以穴位貼敷能調(diào)理肺脾、固護衛(wèi)表,增強反復呼吸道感染患兒免疫功能,減少呼吸道感染頻次[21]；玉屏風散可提高機體免疫力，降低炎癥因子水平，使慢性鼻竇炎患者臨床癥狀得到明顯改善[22]；玉屏風散可改善慢支病人的免疫狀態(tài)，提高外周血中C3、C4、IgA、IgG及IgM含量，使體弱、易呼吸道感染患兒發(fā)病次數(shù)明顯減少[23]。

本實驗結(jié)果表明，隔藥餅灸能改善模型大鼠的生存狀態(tài)，改善肺及氣管組織的病理變化，升高CD4+、CD8+、CD4+/CD8+，起到對免疫紊亂的調(diào)節(jié)作用。T淋巴細胞被激活后究竟是怎樣進一步影響慢支大鼠的免疫系統(tǒng)，緩解氣道炎癥，相關的影響及機制仍需進一步研究。