大孔樹脂純化黃精多酚及其抗氧化性與組成分析

巫永華，張建萍，趙節(jié)昌，陳安徽，邵 穎，劉恩岐

大孔樹脂純化黃精多酚及其抗氧化性與組成分析

巫永華，張建萍，趙節(jié)昌，陳安徽，邵 穎，劉恩岐※

（徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221018）

考察4種樹脂對黃精多酚粗提物的吸附-解吸特性，篩選出最佳的純化樹脂，并研究其純化工藝，分析黃精多酚的體外抗氧化活性、紅外光譜特性和單酚組成。結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂最適合于對黃精多酚粗提液的純化，靜態(tài)吸附5 h達(dá)到飽和，靜態(tài)解吸3 h達(dá)到平衡；在室溫下，用質(zhì)量濃度為0.80 mg/mL 的黃精多酚粗提液以 0.8 mL/min 的流速上樣；吸附平衡后以70%的乙醇為洗脫劑，在洗脫流速為1 mL/min時(shí)，大孔樹脂純化效果最好，經(jīng)純化后黃精多酚的純度提高了3.37倍。黃精多酚具有較好的抗氧化能力，且具有良好的量效關(guān)系，純化前后黃精多酚總還原能力的IC50值分別為(27.48±1.93)、(19.01±1.48)g/mL，清除DPPH?的IC50值依次為(5.21±0.48)、(4.00±0.26)g/mL，清除ABTS+?的IC50值依次為(4.89±0.82)、(4.21±0.53)g/mL，經(jīng)純化后黃精多酚的抗氧化活性明顯增強(qiáng)。紅外光譜分析表明其具有多酚和黃酮的特征峰；HPLC-DAD分析表明，黃精多酚主要含綠源酸，阿魏酸，蘆丁和熊果酸。

多酚；樹脂；純化；黃精；抗氧化活性；組成分析

0 引 言

黃精（）作為中國傳統(tǒng)的一種藥食同源植物，具有補(bǔ)氣滋陰，補(bǔ)腎，益脾，潤肺等功效[1]。研究人員從黃精中獲得了多糖、黃酮類、皂苷類、生物堿、木質(zhì)素和氨基酸等活性成分[2]，大量研究表明黃精的抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血脂、延緩衰老、改善記憶力和抗病毒、提高免疫力、抗腫瘤、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和促進(jìn)睡眠等功能與其活性物質(zhì)密切相關(guān)[3-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃精中含有一定量的多酚類化合物，并優(yōu)化了閃式提取法提取黃精多酚的工藝，抗氧化試驗(yàn)顯示其多酚粗提物具有較好的抗氧化能力[8-9]。但由于多酚粗提液中含有大量的糖類和少量的蛋白質(zhì)、生物堿等雜質(zhì)，對其生理活性的評價(jià)往往準(zhǔn)確性不夠，無法判斷其生物活性的構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制，因此探討合適的方式分離純化以獲得純度較高的目標(biāo)組分，并評價(jià)其生理功能和結(jié)構(gòu)鑒定是重要的研究方向。

在對天然活性化合物的分離純化中，大孔吸附樹脂因其具有良好的吸附選擇性和穩(wěn)定性，不易受酸堿和雜質(zhì)的影響，同時(shí)還有吸附量大、吸附解吸條件溫和、操作簡單、安全性好和可回收再生、使用周期長、有利于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而被國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注[10-11]。眾多研究表明，不同的大孔吸附樹脂對不同來源的多酚物質(zhì)有吸附選擇性，Guo等[12]研究表明獼猴桃果皮提取物中多酚類物質(zhì)經(jīng)NKA-II樹脂純化后純度由33.2% 提高到了55.26%。Gao等[13]考察大孔吸附樹脂純化野櫻莓多酚時(shí)，發(fā)現(xiàn)XAD-7樹脂的純化效果最好。張卉等[14]優(yōu)化了XAD-7樹脂純化黑果腺肋花楸多酚的工藝條件，經(jīng)純化后多酚純度由9.56%提高到了74.26%。王艷麗等[15]研究表明AB-8樹脂可以較好地純化酸漿果實(shí)多酚。采用大孔吸附樹脂對黃精多酚類化合物的研究未見報(bào)道，試驗(yàn)考察4種大孔吸附樹脂對黃精粗多酚的純化效果，篩選最佳的純化樹脂，并進(jìn)行純化工藝優(yōu)化，分析純化后黃精多酚的抗氧化活性、紅外光譜特性和多酚組成，為黃精多酚類物質(zhì)生物活性的構(gòu)效分析和在功能性食品、藥品和化妝品中的利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精，安徽亳州千草藥業(yè)有限公司提供；AB-8樹脂，天津波鴻樹脂科技有限公司；NKA-9樹脂，天津浩聚樹脂科技有限公司；抗壞血酸、SP-825、XAD-2樹脂，上海源葉生物科技有限公司；DPPH，美國sigma公司；ABTS，Amresco公司；溴化鉀（光譜純），美國Acros Organics公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHBE-50T閃式提取器，河南智晶生物科技發(fā)展有限公司；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；1260Ⅱ高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；HH-1恒流泵，上海嘉鵬科技有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司；L550離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo fisher公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃精粗多酚的制備

用粉碎機(jī)將黃精粉碎，過80目篩，用自封袋包裝，置于干燥器中保存，備用。參照課題組前期獲得的方法制備黃精多酚[9]。取適量的黃精粉于提取罐，按質(zhì)量體積比為1:20（g/mL），加入50%乙醇，在電壓為150 V下提取35 s，抽濾，濾渣再重復(fù)提取一次，合并2次濾液后真空濃縮至一定體積后加入無水乙醇至醇濃度為80%，4 ℃下靜置過夜后離心，上清液濃縮后冷凍干燥，得到黃精粗多酚粉，置于?20 ℃下保存，備用。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理

參照陳純[16]的方法并稍作修改，將AB-8、NKA-9、SP-825和XAD-2 4種不同的大孔樹脂分別置于無水乙醇中浸泡24 h后，用純水淋洗至無乙醇味，再用5%NaOH溶液浸泡6 h，用純水洗至洗出液為中性，最后用5%HCl溶液浸泡6 h，再用純水洗至中性，抽濾，備用。

1.3.3 最佳純化樹脂的篩選

參照吳蘭蘭[17]報(bào)道的方法略有改動(dòng)，通過靜態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)篩選出對黃精多酚分離性能良好的樹脂。準(zhǔn)確稱取上述樹脂各10.00 g，分別加入200 mL質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的黃精多酚粗提液，于25 ℃、100 r/min下振蕩24 h，使其吸附飽和，測定上清液中的總酚含量。抽濾去除上清液后，加入100 mL、70%的乙醇，同樣條件下洗脫24 h，測定上清液中的總酚含量。按公式（1）和（2）計(jì)算樹脂的吸附、解吸率：

吸附率/%=(0?1)/0×100%（1）

解吸率/%=2/(0?1)×100%（2）

式中0為初始多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；1為吸附后上清液中的多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；2：解吸后洗脫液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4 AB-8樹脂靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

1）AB-8樹脂吸附和解吸時(shí)間的確定

取10.00 g預(yù)處理好的AB-8樹脂，加入質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的樣品液200 mL，在25 ℃、100 r/min下水浴振蕩，每隔1 h測上清液的多酚含量，至濃度無明顯變化為止。倒去上清液，加入70%的乙醇200 mL，在25 ℃、100 r/min下水浴振蕩，每隔1 h測定洗脫液中的多酚含量，至濃度無明顯變化為止，分別計(jì)算吸附和解吸率，確定最佳的吸附和解吸時(shí)間。

2）多酚初始濃度對樹脂吸附效果的影響

取10.00 g預(yù)處理好的AB-8樹脂7份，分別加入200 mL的質(zhì)量濃度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL的黃精粗多酚溶液，在25 ℃、100 r/min下水浴振蕩2 h，測定上清液中多酚的含量，計(jì)算吸附率。

3）乙醇濃度對樹脂解吸效果的影響

取10.00 g預(yù)處理好的AB-8樹脂5份，分別加入質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的樣品液200 mL，在25 ℃、100 r/min下水浴振蕩2 h，測定上清液中多酚的含量。抽濾去除上清液后分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇200 mL，在25 ℃、100 r/min下水浴振蕩3 h，測定洗脫液中的多酚含量，計(jì)算解吸率。

1.3.5 AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

1）上樣流速對樹脂吸附效果的影響

稱取適量經(jīng)處理好的AB-8樹脂，采用濕法裝柱的方式裝入玻璃層析柱（2.0 cm×50 cm），以1 mL/min速度泵入純水1h，待樹脂柱平衡后，將質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 的樣液分別以0.4、0.8、2.4 mL/min的流速上柱，使用自動(dòng)收集器以每10 mL為一管收集流出液，測定流出液中的多酚濃度。

2）洗脫速度對樹脂解吸效果的影響

在多酚質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL上樣速度為0.8 mL/min條件下上樣40 mL，吸附2 h后，用70%的乙醇在洗脫速度分別為0.5、1.0、1.5 mL/min下洗脫，每6 mL為一管收集流出液，測定其多酚濃度。

1.3.6 總酚含量的測定

參考文獻(xiàn)[9]的方法。配制質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2和5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL棕色容量瓶中，分別加入純水10 mL和福林-酚試劑1 mL后，搖勻，再加入7%的Na2CO3溶液10 mL，漩渦振蕩混勻后定容，在室溫、黑暗條件下放置30 min，測定765nm下的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為=0.0921+0.0346，2= 0.9983。

1.3.7 黃精多酚抗氧化活性的研究

1）還原能力的測定

參考文獻(xiàn)[9]的方法。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL，分別加入0.2 moL/L磷酸緩沖溶液(pH 值6.6) 1 mL和1%的鐵氰化鉀溶液1 mL，漩渦振蕩混勻后于50 ℃下反應(yīng)20min，加入10%三氯乙酸溶液1 mL，混勻后3000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入純水2.5 mL和0.1%氯化亞鐵溶液0.5 mL，混勻后測定700 nm處的吸光度，并以抗壞血酸作陽性對照。

2）DPPH?清除能力的測定

參考文獻(xiàn)[9]的方法。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL的DPPH溶液2.0 mL，在室溫、黑暗條件下放置30 min后，于4000 r/min離心10 min，于517 nm處測定上清液吸光值，按式（3）計(jì)算DPPH?清除率，并以抗壞血酸作陽性對照。

DPPH?清除率/%=[1?(1?2)/0]×100%（3）

式中0為2 mL乙醇與2 mL DPPH溶液混合液的吸光值；1為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液混合液的吸光值；2為2 mL樣品溶液與2 mL乙醇混合液的吸光值

3）ABTS+?清除能力的測定

參考文獻(xiàn)[9]的方法。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.2 mL，分別加入ABTS溶液4.8 mL，在室溫、黑暗條件下放置15 min后，測定734 nm處的吸光值。按式（4）計(jì)算ABTS+?清除率，并以抗壞血酸作陽性對照。

ABTS+?清除率/%=[1?(1?2)/0]×100%（4）

式中0為0.2 mL乙醇與4.8 mL ABTS溶液混合液的吸光值；1為0.2 mL樣品溶液與4.8 mL ABTS溶液混合液的吸光值；2為0.2 mL樣品溶液與4.8 mL乙醇混合液的吸光值。

1.3.8 黃精多酚的FT-IR分析

取黃精多酚純化物凍干粉1～2 mg與200 mg烘干后的溴化鉀混合均勻，用瑪瑙研缽研磨至粒徑小于2m。用壓片機(jī)壓成均勻透明的薄片后，在波長4000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，獲得FT-IR圖。

1.3.9 高效液相色譜法分析黃精多酚單酚組分及含量

分別用稱取20 mg的沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚和熊果酸，用甲醇溶解，配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)液，各取120L混合配成10種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別用0.22m 濾膜過濾后用于HPLC檢測。樣品用甲醇溶解后，用0.22m濾膜過濾后檢測。

分析條件：采用安捷倫1260ⅡHPLC 系統(tǒng)，二極管陣列（DAD）檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5m）。參考史斌斌[18]的方法，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果稍作修改，流動(dòng)向A為0.8%乙酸，B為甲醇，柱溫28 ℃，進(jìn)樣量20L，流速0.9 mL/min。流動(dòng)相洗脫方法見表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫比例

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)處理、繪圖采用Excel 2010軟件，數(shù)據(jù)差異性分析使用SPSS 18.0 軟件；IC50值由曲線增長階段擬合線性方程后計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種大孔樹脂對黃精多酚吸附和解吸性能的比較

不同的大孔樹脂由于其極性、比表面積和孔徑等不同，對天然產(chǎn)物會(huì)表現(xiàn)出不同的吸附和解吸性能。圖1顯示所選的4種大孔吸附樹脂對黃精多酚的吸附解吸效果，由圖可知，AB-8樹脂對黃精多酚粗提液的吸附率為85.72%，顯著高于其他型號樹脂（<0.05）。解吸試驗(yàn)表明AB-8樹脂的解吸效果顯著高于NKA-9和SP-825（<0.05），與XAD-2無顯著差異。可能是AB-8樹脂具有較大的比表面積，更適宜吸附黃精多酚類分子，同時(shí)AB-8樹脂為弱極性，可以更好的把黃精多酚從柱子上解吸下來。由于多酚類化合物的分子中含有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，其分子的極性不高，所以弱極性或非極性的樹脂吸附效果較好[19]。因此，選擇AB-8大孔樹脂作為分離純化黃精多酚的最佳樹脂。劉軍偉報(bào)道認(rèn)為AB-8樹脂對生姜多酚具有較好的純化方式[20]；馬雙雙[21]對蓮子殼多酚的純化研究和尚丹對香蕉皮多酚的純化[22]也得出了相同結(jié)果。不同的是艾志錄等[23]認(rèn)為NKA-9樹脂能更好的富集純化蘋果多酚；陶莎等[24]研究認(rèn)為HPD 600樹脂對紅小豆多酚純化效果較佳，不同的結(jié)果可能是由于多酚的來源不同，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)不一樣導(dǎo)致的。

注：同一指標(biāo)不同字母代表差異顯著，下同

2.2 AB-8樹脂靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 樹脂吸附和解吸時(shí)間的確定

1）吸附時(shí)間的確定

大孔樹脂的吸附是利用樹脂多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和高比表面積形成的分子篩作用，也與樹脂和目標(biāo)物之間的范德華引力或氫鍵締合能力有關(guān)[25]，吸附時(shí)間會(huì)影響其吸附效果。由圖2a可見，在吸附開始的2 h內(nèi)，多酚的吸附率迅速上升至（76.43±1.67）%，隨后3 h緩慢上升至吸附飽和狀態(tài)，其吸附率為（84.25±1.02）%，隨后吸附率無明顯變化。故選擇5 h為最佳吸附時(shí)間。

2）解吸時(shí)間的確定

由圖2b可見，在解吸開始的3 h 內(nèi)，多酚的解吸率迅速上升，隨后逐漸趨于平穩(wěn)。故認(rèn)為在解吸3 h時(shí)解吸達(dá)到平衡。而在解吸的后期，解吸率出現(xiàn)輕微降低，結(jié)果與鄭翠萍報(bào)道的相似[26]。可能是由于過長的解吸時(shí)間，樹脂出現(xiàn)了復(fù)吸現(xiàn)象。

2.2.2 多酚初始濃度對樹脂吸附效果的影響

由圖3可見，在多酚濃度較低時(shí)，AB-8吸附多酚的能力隨著上樣濃度的增加而增加，至0.8 mg/mL達(dá)到最大。當(dāng)上樣濃度超過0.8 mg/mL時(shí)，AB-8吸附多酚的能力隨著上樣濃度的增加而降低?？赡苁堑蜐舛葧r(shí)，大孔樹脂吸附多酚的能力未達(dá)到飽和，還有吸附位點(diǎn)剩余，此時(shí)上樣濃度增加，吸附率也會(huì)相應(yīng)增加；在較高的濃度時(shí)，多酚與雜質(zhì)爭奪吸附位點(diǎn)，多酚吸附率降低。此外，濃度增大時(shí)，上樣液會(huì)有絮凝、沉淀等現(xiàn)象，同時(shí)溶液粘度也會(huì)隨溶液濃度的增加而增大，傳質(zhì)阻力增大，進(jìn)而導(dǎo)致吸附率的降低[27]。因此，初始黃精多酚濃度為0.8 mg/mL時(shí)最佳。

圖3 上樣濃度對吸附率的影響

2.2.3 乙醇濃度對樹脂解吸效果的影響

考察不同溶度乙醇對吸附飽和的樹脂進(jìn)行解吸，結(jié)果見圖4所示。由圖可知，隨著乙醇濃度的增加，解吸率也得以提高。當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，解吸率達(dá)到61.8%；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，解吸率隨之下降?？赡苁怯捎谝掖紳舛容^低時(shí)，樹脂和多酚之間形成的氫鍵未被充分的破壞[19]，導(dǎo)致多酚解吸率低；而當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí)，此時(shí)溶液的極性與多酚的極性相差也隨之增大，根據(jù)相似相溶原理，黃精多酚在乙醇溶液中的溶解度變低，解吸不完全導(dǎo)致多酚解吸率下降。因此，乙醇濃度為70%時(shí)最適宜。周躍勇[28]在對獼猴桃多酚進(jìn)行純化和何婷等[29]純化龍眼核多酚時(shí)也獲得了相似的結(jié)果。

圖4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對解吸率的影響

2.3 AB-8樹脂靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 上樣流速對樹脂吸附效果的影響

當(dāng)流出液多酚的質(zhì)量濃度為初始上樣液多酚濃度的10%時(shí)，是樹脂的泄漏點(diǎn)，該點(diǎn)可以用來選擇合適的上樣流速[26]。由圖5可見，隨著流出液體積的增大，流出液中的多酚物質(zhì)在逐漸增多，說明黃精多酚的吸附率在慢慢地降低；在不同的上樣流速下，相同流出液體積的多酚吸附率不同，上樣流速越大，吸附率越低?？赡苁且?yàn)樯蠘恿魉佥^大時(shí)，多酚物質(zhì)不能與樹脂充分接觸、吸附，從而造成樹脂對提取液中多酚物質(zhì)吸附率的下降[14]；當(dāng)上樣液流速較小時(shí)，多酚物質(zhì)可以充分被樹脂吸附，吸附效果就會(huì)較好，但如果流速太小，生產(chǎn)效率就會(huì)降低，就會(huì)延長生產(chǎn)的周期，提高生產(chǎn)的成本。因此，綜合考慮，上樣流速為0.8 mL/min時(shí)比較適宜，此流速條件下最佳上樣量為40 mL。

圖5 上樣流速對吸附效果的影響

2.3.2 洗脫速度對樹脂解吸效果的影響

洗脫速度對樹脂解吸效果的見圖6所示。隨著洗脫液流速變大，洗脫帶加寬，拖尾現(xiàn)象越來越明顯?？赡苁怯捎谙疵撘毫魉偌涌鞎r(shí)，洗脫液與被樹脂吸附的多酚沒來得及進(jìn)行充分的解吸作用，因而不能將其從樹脂的吸附位點(diǎn)上置換下來，進(jìn)而造成洗脫效果較差。但如果洗脫液流速過慢，解吸時(shí)間隨之會(huì)延長，同時(shí)被洗脫下來的多酚可能會(huì)被重新吸附，樹脂與多酚物質(zhì)間會(huì)重新建立動(dòng)態(tài)平衡，降低解吸量[30]，另外，也會(huì)使生產(chǎn)周期延長，生產(chǎn)成本增加。因此，綜合考慮1 mL/min作為洗脫液的洗脫流速，洗脫液體積為108 mL。在此條件下經(jīng)AB-8樹脂純化后，黃精多酚的回收率為76.52%。

圖6 洗脫流速對解吸效果的影響

2.4 黃精多酚純化前后抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

黃精多酚粗提物、純化物和Vc的總還原能力和對DPPH?、ABTS+?清除能力的結(jié)果見圖7～圖9及表2所示，總體而言，隨著粗提物、純化物和對照品Vc濃度增加，其總還原能力和對DPPH?、ABTS+自由基清除能力也逐漸增強(qiáng)，并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系。其中純化液在質(zhì)量濃度為10g/mL時(shí)，清除率DPPH?和ABTS+?的能力達(dá)到了97.25%和92.63%，說明黃精多酚中含有一定的供氫體，能提供氧質(zhì)子，能夠還原高度氧化性的自由基，進(jìn)而終止自由基的連鎖反應(yīng)，起到一定的抑制或清除自由基的效果[25]。由表2可知，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后黃精多酚的純度由（15.65±1.24）%，提高到了（68.38±1.98）%，提高了3.37倍，表明經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后，黃精粗多酚中蛋白、糖類和色素等雜質(zhì)得到了有效的去除，實(shí)現(xiàn)了黃精多酚組分的富集、純化，提示AB-8樹脂較適于黃精多酚粗提物的分離純化。純化后多酚的總還原力和清除DPPH?的IC50值分為（19.01±1.48）和（4.00±0.20）g/mL，顯著高于純化前的多酚和Vc的相應(yīng)值（<0.05）；純化后樣品對ABTS+?清除能力要高于純化前樣品和Vc的清除能力，但沒有顯著差異，結(jié)果表明黃精多酚具有較好的抗氧化能力，且純化后其抗氧化能力進(jìn)一步提高。許多研究表明[31-33]，經(jīng)過大孔樹脂純化后，多酚類化合物的抗氧化活性會(huì)增強(qiáng)，可能是由于大孔樹脂對多酚類物質(zhì)起到了純化和富集的作用，使得其純度和總酚含量提高，從而增強(qiáng)了其抗氧化能力。但也有報(bào)道認(rèn)為多酚的分子和酚羥基的數(shù)量及其所在的位置會(huì)影響其抗氧化特性[34]。

圖7 總還原能力對比

圖8 黃精多酚對DPPH?的清除能力

圖9 黃精多酚對ABTS+?的清除能力

表2 黃精多酚對不同抗氧化反應(yīng)體系抗氧化效果的比較（IC50值）

注：同一指標(biāo)不同字母上標(biāo)表示差異顯著。

Note: Significant differences between different superscripts in the same index.

2.5 黃精多酚的紅外光譜分析

黃精多酚純化物的紅外光譜測定結(jié)果見圖10，其中在3 408.56 cm-1波數(shù)處出現(xiàn)的吸收峰是由于O-H的伸縮振動(dòng)而引起的，是酚類物質(zhì)的重要特征[35]；在2 918.87 cm-1波數(shù)處的吸收峰是-CH2-的C-H伸縮振動(dòng)引起的[36]；波數(shù)在2 000～1 400 cm-1范圍的吸收峰表明該化合物具有芳香族特性[37]，1 758.33 cm-1波數(shù)處的峰是羰基C═O伸縮振動(dòng)引起的，該峰歸屬于黃酮類物質(zhì)，表明黃精多酚中含有黃酮類化合物；在1 628.66 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，進(jìn)一步表明黃精多酚中含有黃酮類物質(zhì)[38]。1 581.98和1 445.65 cm-1出現(xiàn)的峰是苯環(huán)上的C=C伸縮振動(dòng)引起的；1 384.32 cm-1是由于C-H彎曲振動(dòng)而引起的吸收峰；1 130.22 cm-1受到C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)影響；952.38、885.74及758.36 cm-1出現(xiàn)的吸收峰是C-H面外彎曲振動(dòng)引起的。

圖10 黃精多酚純化物的紅外光譜圖

2.6 黃精黃精多酚組成及含量分析

采用單一標(biāo)準(zhǔn)品分別確定其出峰時(shí)間，并以10種單體酚為混合標(biāo)樣，采用HPLC-DAD測定黃精多酚純化物的組成成分，并對其含量進(jìn)行測定。由圖11和表3可知，黃精多酚純化物中綠原酸，阿魏酸，蘆丁和熊果酸的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)間一致，可以初步認(rèn)為其含有這4種單酚成分，其中熊果酸和蘆丁的含量較高，分別為（57.24±1.24）和（23.17±0.79）g/mL，這也可能是黃精多酚具有較高的抗氧化能力的原因。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在保留時(shí)間為8.46、11.35、29.34 min處有3未知個(gè)峰，需要進(jìn)一步分析。

1.沒食子酸 2.兒茶素 3.綠原酸 4.咖啡酸 5.表兒茶素 6.阿魏酸 7.蘆丁 8.槲皮素 9.山奈酚 10.熊果酸

1.Gallic acid 2.Catechins 3.Chlorogenic acid 4.Caffeic acid 5.Epicatechins 6.Ferulic acid 7.Rutin 8.Quercetin 9.Kaempferol 10.Ursolic acid

圖11 多酚標(biāo)準(zhǔn)品和純化后黃精多酚的HPLC圖

Fig.11 HPLC results of polyphenols standard and purified polygonatum polyphenols

表3 山楂葉多酚純化后單體酚種類及含量

3 結(jié) 論

采用大孔樹脂對黃精多酚粗提液進(jìn)行純化，通過測定其總還原能力、對DPPH?和ABTS+?的清除能力來分析純化前后黃精多酚的抗氧化活性。試驗(yàn)確定了AB-8大孔樹脂為對黃精多酚的最佳純化樹脂，其純化工藝為，靜態(tài)吸附5 h達(dá)到飽和，靜態(tài)解析3 h達(dá)到平衡；以質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的黃精多酚粗提液在流速為0.8 mL/min時(shí)上樣40 mL，吸附平衡后采用70%的乙醇作為洗脫劑，在洗脫流速為1 mL/min下洗脫108 min，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的黃精多酚回收率為76.52%，純化前后黃精多酚的純度由（15.65±1.24）%，提高到了（68.38±1.98）%，提高了3.37倍?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，黃精多酚的抗氧化能力與其濃度具有較強(qiáng)的量效關(guān)系，黃精多酚經(jīng)純化后的總還原能力和對DPPH?及ABTS+?的IC50值分別為（19.01±1.48）、（4.00±0.26）、（4.21±0.53）g/mL，抗氧化活性明顯優(yōu)于粗提物和Vc，表明AB-8樹脂多黃精多酚具有較好的純化和富集作用。紅外光譜分析表明其具有多酚和黃酮的特征峰。HPLC分析表明黃精多酚主要含綠原酸，阿魏酸，蘆丁和熊果酸。試驗(yàn)結(jié)果為黃精多酚類物質(zhì)的進(jìn)一步研究和在保健食品方面的利用提供了基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。后續(xù)研究會(huì)對其在經(jīng)過高速逆流、制備色譜等技術(shù)純化后，采用質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)進(jìn)行鑒定分析。

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Antioxidantion and composition analysis of purified polygonatum sibiricum polyphenols using macroporous resin

Wu Yonghua, Zhang Jianping, Zhao Jiechang, Chen Anhui, Shao Ying, Liu Enqi※

(,,, 221018,)

becomes generally used as a sort of traditional medicinal herbs for thousands of years in China. This herbs contains a large number of active ingredients, such as polysaccharides, flavonoids, polyphenols, to cure many physiological functions including antioxidant, anti-fatigue, hypoglycemic, hypolipidemic, anti-cancer etc. This present work focused on the purification processing of the rawpolyphenols by using the specific macroporous resin. A sort of resin, named AB-8, was chosen as the ideal adsorbent due to the best adsorption and the desorption rate forpolyphenols, after the comparison test for the adsorption-desorption characteristics of four different types of resins (AB-8, NKA-9, SP-825 and XAD-2) for crudepolyphenols. In the static/dynamic adsorption and desorption experiments, the sample concentration, flow velocity of samples, ethanol concentration and flow velocity of desorption showed great influence on the macroporous resin in the process of separating and purifying thepolyphenols. The ideal purification parameters for the resin of AB-8 were as follows, at room temperature, the concentration of crude polyphenol was 0.80 mg/mL with the flow velocity of 0.8 mL/min, and 70% ethanol was used as the eluent solvent with the elution flow rate of 1 mL/min. The Folin-phenol reagent method was adopted to determine the total phenol content during the purification. The results showed that the purity ofpolyphenols after purification by AB-8 resin increased by 3.37 times than the crude polyphenol extract indicating that AB-8 resin has great adsorption and enrichment effect forpolyphenols. The total reduction capacity, scavenging capacity of DPPH? and ABTS+? were measured to investigate the antioxidant capacity of crude and purifiedpolyphenols. The obtained results showed thatpolyphenols possessed good antioxidant capacity with the dose-effect relationship. IC50values of total reduction capacity ofpolyphenols before and after purification were (27.48+1.93)g/mL, (19.01+1.48)g/mL, IC50values of DPPH? scavenging activities were (5.21+0.48)g/mL, (4.00+0.26)g/mL, and IC50values of ABTS+? scavenging activities were (4.89+0.82)g/mL and(4.21±0.53)g/mL, respectively. Obviously, the antioxidant activity ofpolyphenols was significantly enhanced after purification. The infrared spectrum and HPLC were also used to analyze the structure characteristics and compositions of the purified products. The characteristic peaks of some polyphenols and flavones can be detected, wherepolyphenols mainly contains green source acid, ferulic acid, rutin and ursolic acid. The present study can provide a scientific basis for the structure-activity analysis ofpolyphenols and their promising utilization in the functional food, medicine and cosmetics.

polyphenols; resins; purification;; antioxidant activity; composition analysis

巫永華，張建萍，趙節(jié)昌，陳安徽，邵 穎，劉恩岐. 大孔樹脂純化黃精多酚及其抗氧化性與組成分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(1)：318－326.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.01.038 http://www.tcsae.org

Wu Yonghua, Zhang Jianping, Zhao Jiechang, Chen Anhui, Shao Ying, Liu Enqi. Antioxidantion and composition analysis of purified polygonatum sibiricum polyphenols using macroporous resin[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(1): 318－326. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.01.038 http://www.tcsae.org

2019-08-26

2019-09-24

徐州工程學(xué)院科研項(xiàng)目(XKY2017240)；安徽省科技重大專項(xiàng)(17030801019）；國家自然基金項(xiàng)目（31701566）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（BE2017352）聯(lián)合資助

巫永華，實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品資源開發(fā)與利用研究。Email：yonghuawu2006@163.com

劉恩岐，教授，博士，主要從事食品資源開發(fā)與利用研究。Email：xiaoyaohai777@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.01.038

TS206.4

A

1002-6819(2020)-01-0318-09