一次性生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展

王遠(yuǎn)山，朱旭，牛坤，徐建妙

（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310032；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程中心，浙江杭州310032）

一次性生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展

王遠(yuǎn)山1，2，朱旭1，2，牛坤1，2，徐建妙1，2

（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310032；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程中心，浙江杭州310032）

對(duì)一次性生物反應(yīng)器的發(fā)展歷程、特點(diǎn)、應(yīng)用及放大等進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)介紹了波浪混合式、攪拌式和軌道振搖式三種一次性生物反應(yīng)器，并對(duì)一次性生物反應(yīng)器面臨的挑戰(zhàn)及其未來(lái)發(fā)展進(jìn)行了展望。

一次性生物反應(yīng)器；工作原理；應(yīng)用；放大

一次性生物反應(yīng)器（Disposable bioreactor或Single use bioreactor，SUB）是由美國(guó)食品藥品管理局（FDA）認(rèn)證的塑料材料（聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯等）制成，是一種即裝即用、不可重復(fù)利用的培養(yǎng)器［1］。首先，反應(yīng)器預(yù)先滅菌，省去了SIP（在線(xiàn)消毒）和CIP（在線(xiàn)清洗），因此，可以快速地投入生產(chǎn)使用，進(jìn)而縮短生產(chǎn)周期。并且，從生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）的角度來(lái)講，節(jié)約了高額的清潔驗(yàn)證費(fèi)用。同時(shí)，傳統(tǒng)不銹鋼反應(yīng)器由于需要SIP和CIP環(huán)節(jié)，會(huì)造成大量水和能源的消耗，從而對(duì)環(huán)境有一定影響。相對(duì)而言，一次性生物反應(yīng)器所產(chǎn)生的廢棄物對(duì)環(huán)境的影響小很多［2］。其次，一次性生物反應(yīng)器一次性投入資金低，是許多中小型生物公司的較佳選擇。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，企業(yè)產(chǎn)能增加，某些領(lǐng)域甚至超過(guò)了市場(chǎng)需求量，導(dǎo)致部分不銹鋼生物反應(yīng)器的閑置浪費(fèi)，而如果使用一次性生物反應(yīng)器則可以較容易進(jìn)行工藝轉(zhuǎn)換，用于其他藥品生產(chǎn)，最大限度地降低資金浪費(fèi)。隨著多元化市場(chǎng)（抗體、細(xì)胞治療和基因治療等）的需求，特別是對(duì)于小規(guī)模生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品，一次性生物反應(yīng)器的生產(chǎn)成本較不銹鋼生物反應(yīng)器更低。另外，一次性生物反應(yīng)器不僅可以提高生產(chǎn)有毒或傳染性的產(chǎn)品時(shí)的安全性，還可以降低生產(chǎn)多種產(chǎn)品時(shí)的交叉污染。

目前一次性生物反應(yīng)器已廣泛應(yīng)用于種子擴(kuò)大培養(yǎng)，小到中試規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)，單克隆抗體（monoclonal antibodies，MAbs）、疫苗和重組蛋白等的生產(chǎn)，并逐漸拓展到微生物發(fā)酵、藻類(lèi)培養(yǎng)等領(lǐng)域。其最大的商業(yè)用途是用于種子擴(kuò)大培養(yǎng)以及培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)抗體、疫苗等。另外，一次性生物反應(yīng)器在大規(guī)模的菌株篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化中也逐漸得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，近77%的制藥公司及合同研究組織（Contract Research Organizations，CROs）已利用一次性生物反應(yīng)器進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)［2］?？梢?jiàn)，一次性生物反應(yīng)器已成為生物制藥領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方向。

1　一次性生物反應(yīng)器的發(fā)展歷程、特點(diǎn)及其應(yīng)用

1963年，F(xiàn)alch等使用由聚丙烯或聚四氟乙烯制成的既簡(jiǎn)單又便宜的一次性四面體塑料袋在搖床上培養(yǎng)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens），研究發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)容器的曝氣效率是錐形瓶的三倍［3］。1972年，Knazek等開(kāi)發(fā)的第一套中空纖維膜生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物細(xì)胞的體外高濃度培養(yǎng)［4］。1975年，Nunc公司開(kāi)發(fā)了更易于放大的Cell Factory反應(yīng)器。在20世紀(jì)90年代，Cell Factory反應(yīng)器不僅替代了滾瓶，而且研究表明其很適合符合GMP要求的疫苗和治療性蛋白生產(chǎn)。1995年，利用miniPERM和CeLLine一次性生物反應(yīng)器在體外生產(chǎn)抗體等技術(shù)開(kāi)始進(jìn)入人們的視線(xiàn)，并且CeLLine因適合細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)、篩選實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)室規(guī)模臨床前樣品的制備而廣受歡迎［5］。

1.1波浪混合式一次性生物反應(yīng)器（Wave-mixed disposable bioreactor）

1996年，Singh發(fā)明了新型波浪混合式一次性生物反應(yīng)器，帶來(lái)了細(xì)胞培養(yǎng)行業(yè)的革命。1998年，Wave Biotech公司推出了第一臺(tái)用于商業(yè)化生產(chǎn)的波浪混合式一次性生物反應(yīng)器WAVE Bioreactor 20，從此，一次性生物反應(yīng)器開(kāi)始大規(guī)模應(yīng)用。繼WAVE Bioreactor 20在哺乳動(dòng)物細(xì)胞種子擴(kuò)大培養(yǎng)中獲得成功后［6］，Wave Biotech公司于1999年推出了培養(yǎng)體積更大的WAVE Bioreactor 500［7］。早期的波浪混合式一次性生物反應(yīng)器主要用于種子擴(kuò)大培養(yǎng)，后來(lái)逐漸擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模［8］。目前波浪混合式一次性生物反應(yīng)器的最大培養(yǎng)規(guī)?？蛇_(dá)到500 L。當(dāng)前主要的商業(yè)化的波浪混合式一次性生物反應(yīng)器如表1所示（本文所有表中信息均來(lái)自于各供應(yīng)商官網(wǎng)）。

表1　主要的商業(yè)化波浪混合式一次性生物反應(yīng)器

波浪混合式一次性生物反應(yīng)器的主要部件為一個(gè)已滅菌的一次性塑料細(xì)胞培養(yǎng)袋，以GEHealthcare公司生產(chǎn)的WAVE Bioreactor波浪混合式一次性生物反應(yīng)器（如圖1）為例，使用時(shí)，該細(xì)胞培養(yǎng)袋中一半體積裝填培養(yǎng)基，另一半體積則充入由二氧化碳和氧氣組成的混合氣體，細(xì)胞培養(yǎng)袋上配備有除菌空氣過(guò)濾器、無(wú)菌取樣口等各種預(yù)留接口（如圖2）。其細(xì)胞袋安置在搖動(dòng)平臺(tái)上，平臺(tái)的搖動(dòng)使培養(yǎng)基產(chǎn)生波浪（如圖3），這些波浪給培養(yǎng)物提供充分的混合與氧氣傳遞，適合細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。不同供應(yīng)商生產(chǎn)的波浪混合式一次性生物反應(yīng)器的平臺(tái)搖動(dòng)方式及培養(yǎng)袋的設(shè)計(jì)有所不同。因?yàn)椴ɡ嘶旌鲜揭淮涡陨锓磻?yīng)器借助產(chǎn)生的波浪使細(xì)胞和顆粒物質(zhì)離開(kāi)底部并處于均勻懸浮狀態(tài)，所以不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成剪切傷害，不僅克服了傳統(tǒng)攪拌式生物反應(yīng)器攪拌槳槳葉端剪切力高的弊端，而且因?yàn)闊o(wú)須鼓泡，避免了消泡劑的使用。因此，波浪混合式一次性反應(yīng)器較適合培養(yǎng)對(duì)剪切力敏感或在培養(yǎng)過(guò)程中容易產(chǎn)生泡沫的細(xì)胞。影響波浪混合式一次性生物反應(yīng)器傳質(zhì)的因素包括搖動(dòng)速度、搖動(dòng)角度、細(xì)胞袋的幾何特征、填充量、通氣速率、發(fā)酵液的粘度等。作為發(fā)展歷史最悠久的一次性生物反應(yīng)器，波浪混合式一次性生物反應(yīng)器擁有最大的市場(chǎng)占有率。

波浪混合式一次性生物反應(yīng)器應(yīng)用非常廣泛，主要應(yīng)用于種子擴(kuò)大培養(yǎng)［9］、對(duì)剪切力敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞［10］、植物細(xì)胞［11］和昆蟲(chóng)細(xì)胞［12］的培養(yǎng)。波浪混合式一次性生物反應(yīng)器也適用于厭氧或氧需求較低的微生物［13-14］的培養(yǎng)，據(jù)報(bào)道CELL-tainer生物反應(yīng)器的體積溶氧系數(shù)（kLa）可以達(dá)到700 1/h，而對(duì)于其在氧需求量較高（kLa＞800 1/h）的微生物培養(yǎng)中的應(yīng)用還需進(jìn)一步研究［8］。同時(shí)，波浪混合式一次性生物反應(yīng)器的應(yīng)用也在逐步擴(kuò)展到其他領(lǐng)域，如病毒生產(chǎn)［15］、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)［16］、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)［17］等。楊建軍等利用WAVE生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CHO細(xì)胞密度高達(dá)2×107cells/mL時(shí)細(xì)胞仍處于指數(shù)生長(zhǎng)期，可為生產(chǎn)罐提供種子細(xì)胞，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)1∶50～1∶100。該擴(kuò)增方式可顯著減少種子罐的級(jí)數(shù)，最終減少生物制藥企業(yè)種子罐的購(gòu)買(mǎi)投入、運(yùn)行成本和維護(hù)成本，同時(shí)減少種子細(xì)胞的擴(kuò)增時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。并且該擴(kuò)增方式也可適用于雜交瘤細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等懸浮培養(yǎng)方式的種子細(xì)胞的擴(kuò)增［18］。Clincke等在WAVE生物反應(yīng)器中灌注培養(yǎng)CHO細(xì)胞，其最大細(xì)胞密度首次超過(guò)了2.14×108cells/mL［10］。Hillig等分別利用CELL-tainer生物反應(yīng)器和傳統(tǒng)的不銹鋼生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻（Crypthecodinium cohnii）生產(chǎn)二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），研究發(fā)現(xiàn)，雖然二者得到的生物量和DHA濃度相當(dāng)，但由于不銹鋼攪拌反應(yīng)器中泡沫和生物膜的形成，導(dǎo)致其比一次性生物反應(yīng)器中的生物量減少了35%，DHA產(chǎn)率減少了21%。由于CELL-tainer生物反應(yīng)器中沒(méi)有泡沫和生物膜的形成，且能提供充足的氧傳質(zhì)速率，因此，可以用CELL-tainer生物反應(yīng)器替代不銹鋼攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)微藻［19］。Wang等使用WAVE bioreactor 20/ 50 EHT生物反應(yīng)器培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果蠅S2細(xì)胞生產(chǎn)人單克隆抗體，灌注培養(yǎng)時(shí)的最大活細(xì)胞密度達(dá)到1.04×108cells/mL，最大抗體產(chǎn)率達(dá)到1437 mg/（L·day），表明該生物反應(yīng)器適合大規(guī)模培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果蠅S2細(xì)胞生產(chǎn)人單克隆抗體［12］。Junne等利用CELL-tainer生物反應(yīng)器以補(bǔ)料方式培養(yǎng)E.coli，成功將培養(yǎng)體積從12 L放大至120 L，最大細(xì)胞干重達(dá)到了45 g/L［14］。

圖1　商業(yè)化的WAVE Bioreactor波浪混合式一次性生物反應(yīng)器

圖2　WAVE Bioreactor波浪混合式一次性生物反應(yīng)器的Cellbag細(xì)胞培養(yǎng)袋示意圖

圖3　WAVE Bioreactor波浪混合式一次性生物反應(yīng)器的搖動(dòng)平臺(tái)示意圖

1.2攪拌式一次性生物反應(yīng)器（Stirred disposable bioreactor）

雖然攪拌式一次性生物反應(yīng)器出現(xiàn)較晚，但其發(fā)展速度很快。2004年，Hyclone公司推出了第一臺(tái)攪拌式一次性生物反應(yīng)器，最大工作體積為250 L。2006年，攪拌式一次性生物反應(yīng)器的最大工作體積已達(dá)到1 000 L。2007年，GE發(fā)布了專(zhuān)門(mén)用于微生物發(fā)酵的攪拌式一次性生物反應(yīng)器Xcellerex XDR-50 MO。2009年，攪拌式一次性生物反應(yīng)器的最大工作體積達(dá)到了2 000 L。如今，攪拌式一次性生物器已成為應(yīng)用最廣泛的一次性生物反應(yīng)器。當(dāng)今市場(chǎng)上主要的商業(yè)化的攪拌式一次性生物反應(yīng)器如表2所示。

攪拌式一次性生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)基于傳統(tǒng)不銹鋼材質(zhì)攪拌生物反應(yīng)器，不同的是其培養(yǎng)容器使用的是塑料材料。用于中試和生產(chǎn)規(guī)模的攪拌式一次性生物反應(yīng)器，以Sartorius Stedim Biotech公司生產(chǎn)的BIOSTAT STR攪拌式一次性生物反應(yīng)器（如圖4［5］和圖5）為例，其培養(yǎng)容器一般是塑料材質(zhì)的經(jīng)預(yù)滅菌的生物反應(yīng)袋，且有外部支撐容器來(lái)放置該生物反應(yīng)袋，而用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的攪拌式一次性生物反應(yīng)器，以Eppendorf公司生產(chǎn)的New Brunswick CelliGEN BLU攪拌式一次性生物反應(yīng)器（如圖6）為例，其培養(yǎng)容器則是經(jīng)預(yù)滅菌的硬質(zhì)塑料材質(zhì)罐體，其外形接近于傳統(tǒng)的不銹鋼攪拌反應(yīng)器。由于配備葉輪，容易引起局部剪切力較高，因此攪拌式一次性生物反應(yīng)器一般用于培養(yǎng)強(qiáng)健且穩(wěn)定的細(xì)胞。如表2所示，商業(yè)化攪拌式一次性生物反應(yīng)器不僅種類(lèi)和供應(yīng)商較多，而且工作體積范圍廣，最大的工作體積達(dá)2 000 L。攪拌式一次性生物反應(yīng)器的發(fā)展迅速主要有兩個(gè)原因，一是與攪拌式一次性生物反應(yīng)器對(duì)應(yīng)的可重復(fù)利用的攪拌式生物反應(yīng)器是生物技術(shù)生產(chǎn)過(guò)程中使用最普遍、培養(yǎng)條件較容易優(yōu)化的傳統(tǒng)生物器類(lèi)型，并且有利用傳統(tǒng)攪拌生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)驗(yàn)的公司更傾向選擇相對(duì)應(yīng)的攪拌式一次性生物反應(yīng)器，因此，其市場(chǎng)需求也會(huì)相對(duì)較大；二是傳統(tǒng)攪拌式反應(yīng)器長(zhǎng)期的使用經(jīng)驗(yàn)和豐富的理論知識(shí)對(duì)攪拌式一次性生物反應(yīng)器的發(fā)展和放大起到了非常重要的作用。攪拌式一次性生物反應(yīng)器由于易于放大，且培養(yǎng)條件和傳統(tǒng)攪拌式生物反應(yīng)器相似，因此，其商業(yè)化應(yīng)用最廣。

表2　主要的商業(yè)化攪拌式一次性生物反應(yīng)器

攪拌式一次性生物反應(yīng)器主要應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)［20］，也逐步用于植物［11］、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)［21］、人體干細(xì)胞培養(yǎng)［22］等。對(duì)于微生物培養(yǎng)，雖然攪拌式一次性生物反應(yīng)器的對(duì)流換熱系數(shù)比傳統(tǒng)不銹鋼反應(yīng)器低很多，熱交換能力也還有待提高，但其完全可用于種子擴(kuò)大培養(yǎng)［23］。對(duì)于原核微生物發(fā)酵，目前Xcellerex XDR攪拌式一次性生物反應(yīng)器已實(shí)現(xiàn)的最大培養(yǎng)規(guī)模為500 L。Paul等利用1 000 L S.U.B生物反應(yīng)器培養(yǎng)CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)S.U.B中的CHO細(xì)胞的代謝特征、產(chǎn)率及產(chǎn)品質(zhì)量與100 L傳統(tǒng)不銹鋼反應(yīng)器相似，當(dāng)工作體積為1 100 L時(shí)，得到了7.5 kg抗體?？梢?jiàn)，一次性生物反應(yīng)器將可以替代不銹鋼生物反應(yīng)器培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)抗體［20］。Dreher等利用BIOSTAT STR 50生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)E.coli和Pichia pastoris，發(fā)現(xiàn)E.coli的光密度（OD600）可達(dá)175（細(xì)胞干重為60.8 g/L），P.pastoris的細(xì)胞濕重可達(dá)381 g/L，為目前使用一次性生物反應(yīng)器發(fā)酵的最高水平［23］。

圖4　Sartorius Stedim Biotech BIOSTAT STR攪拌式一次性生物反應(yīng)器示意圖

圖5　商業(yè)化的Sartorius Stedim Biotech BIOSTAT STR攪拌式一次性生物反應(yīng)器

圖6　商業(yè)化的New Brunswick CelliGEN BLU攪拌式一次性生物反應(yīng)器

1.3軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器（Orbital shaken disposable bioreactor）

軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器的發(fā)展速度相對(duì)較慢。2001年，Liu等首次使用軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞［24］。2004年，Jesus等首次使用商業(yè)化的TubeSpin生物反應(yīng)器培養(yǎng)CHO細(xì)胞。由于TubeSpin生物反應(yīng)器簡(jiǎn)易的操作和取樣方法，避免了大量操作上的失誤，有利于精確分析，還可以快速獲得最優(yōu)工藝條件［25］，因而沿用至今。2009年，Zhang等開(kāi)發(fā)了2 000 L軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器，成功將CHO細(xì)胞培養(yǎng)體積放大至1 000 L［26］。目前商業(yè)化的軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器最大工作體積可以達(dá)到2 500 L，同時(shí)也是目前為止一次性生物反應(yīng)器所能達(dá)到的最大工作體積。十多年來(lái)，軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器經(jīng)歷了從第一次概念驗(yàn)證到工藝系統(tǒng)的建立，成為一次性生物反應(yīng)器的第三大群體。當(dāng)今市場(chǎng)上主要的商業(yè)化的軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器如表3所示。

軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器依靠一次性塑料材質(zhì)的培養(yǎng)容器圍著中央軸心旋轉(zhuǎn)，在液體中心形成漩渦，振蕩液體在反應(yīng)器壁形成薄膜。薄膜被頂部空間的氧氣所飽和，然后此薄膜迅速與液相主體相結(jié)合［14］，進(jìn)而通過(guò)表面通氣和快速的混合提供較強(qiáng)的氧氣輸送能力。軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器由于表面通氣避免了泡沫的生成，并且與攪拌式一次性反應(yīng)器相比，軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器的培養(yǎng)容器里由于不含有價(jià)格昂貴的攪拌和曝氣裝置，因此其不僅對(duì)細(xì)胞剪切傷害小，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)單和成本效益高等優(yōu)點(diǎn)，這一特點(diǎn)和波浪混合式一次性生物反應(yīng)器類(lèi)似。對(duì)于小規(guī)模的軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器，其培養(yǎng)容器一般為塑料材質(zhì)的微孔板、微孔培養(yǎng)盒、旋轉(zhuǎn)管等；對(duì)于稍大規(guī)模的軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器，以Adolf Kühner AG公司生產(chǎn)的OrbShake SB 200-X軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器（如圖7）為例，其培養(yǎng)容器為一次性塑料袋。軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器區(qū)別于波浪混合式一次性反應(yīng)器和攪拌式一次性反應(yīng)器的特點(diǎn)是流體運(yùn)動(dòng)的確定性良好，使其具有很高的平行使用性。因此，軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器廣泛應(yīng)用于大規(guī)模的菌株篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化，并逐步擴(kuò)大至生產(chǎn)規(guī)模。

表3　主要的商業(yè)化軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器

軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器主要應(yīng)用于氧需求較低的動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的培養(yǎng)［27］。雖然市場(chǎng)上存在的軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器種類(lèi)有限，且其商業(yè)應(yīng)用也相對(duì)較少，但其剪切力低和操作簡(jiǎn)單方便的特點(diǎn)使其在實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用，如動(dòng)物細(xì)胞［28］、微藻［29］、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞［30］、微生物［31］等的培養(yǎng)。Stettler等利用TubeSpin生物反應(yīng)器研究了29種培養(yǎng)基和20種蛋白水解液對(duì)3種CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)及其重組蛋白表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，由于每個(gè)TubeSpin系統(tǒng)的物化條件都相同，因此當(dāng)改變某一參數(shù)時(shí)，得到的評(píng)估結(jié)果具有很高的可信度［28］。Raven等利用SB200-X生物反應(yīng)器培養(yǎng)煙草細(xì)胞（BY-2）生產(chǎn)人IgG抗體M12，并進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，在放大過(guò)程中，除了細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程有些滯后以外，SB200-X生物反應(yīng)器中細(xì)胞的生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的累積情況都和搖瓶培養(yǎng)相似。此研究成功使BY-2細(xì)胞的培養(yǎng)體積放大到100 L，細(xì)胞濕重達(dá)到387 g/L（干重17.8 g/L）［30］。

圖7　商業(yè)化的Adolf Kühner AG OrbShake SB 200-X軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器

根據(jù)市場(chǎng)研究咨詢(xún)公司MarketsandMarktes的報(bào)告，到2019年，一次性生物反應(yīng)器市場(chǎng)將從2.025億美元（2014年）增加至4.709億美元，復(fù)合年增長(zhǎng)率達(dá)18.4%。如表4所示，除上述三種一次性生物反應(yīng)器外，供應(yīng)商們針對(duì)空缺或不足的的應(yīng)用領(lǐng)域開(kāi)發(fā)了種類(lèi)繁多的一次性生物反應(yīng)器，以應(yīng)對(duì)日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。

2　一次性生物反應(yīng)器的放大

生物反應(yīng)器的放大，即將培養(yǎng)過(guò)程從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模逐步放大到生產(chǎn)規(guī)模，同時(shí)也是生物反應(yīng)過(guò)程的放大。它是生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)過(guò)程中的重要組成部分，也是生物技術(shù)成果實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。對(duì)同一培養(yǎng)過(guò)程，雖然使用不同規(guī)模的反應(yīng)器所進(jìn)行的生物反應(yīng)是相同的，但混合狀態(tài)、傳質(zhì)與傳熱速率卻不完全相同，造成了細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物生成速率存在一定差異。其中，傳質(zhì)過(guò)程是放大的核心問(wèn)題，而傳質(zhì)問(wèn)題高度依賴(lài)于培養(yǎng)規(guī)模和空間梯度。因此，在生物反應(yīng)放大過(guò)程中，如何估計(jì)在不同規(guī)模反應(yīng)器中生物反應(yīng)的狀態(tài)以及維持細(xì)胞生長(zhǎng)與生物反應(yīng)速率相似，以創(chuàng)造相同或相似的培養(yǎng)環(huán)境，這就需要進(jìn)行生物反應(yīng)器的放大［32］。由于出色的開(kāi)發(fā)及設(shè)計(jì)原則，傳統(tǒng)的不銹鋼攪拌式生物反應(yīng)器在商業(yè)應(yīng)用中能安全地進(jìn)行過(guò)程放大，經(jīng)過(guò)三十幾年的發(fā)展，其已成為放大的黃金標(biāo)準(zhǔn)。但是，市場(chǎng)上主要的一次性生物反應(yīng)器各自都有自己的特點(diǎn)，或多或少的與不銹鋼攪拌式生物反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，因此一次性生物反應(yīng)器放大變得更復(fù)雜，同時(shí)存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。典型的放大主要基于生物反應(yīng)器的幾何相似（高徑比）以及工程參數(shù)（單位體積的功率輸入（P/VL）、kLa、攪拌器尖端速度（utip）、攪拌時(shí)間等）進(jìn)行。對(duì)于微生物培養(yǎng)，熱交換面積可作為放大標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于細(xì)胞的微載體培養(yǎng)，其懸浮狀態(tài)也可作為放大標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)一次性生物反應(yīng)器的工程特征及參數(shù)越了解，放大就相對(duì)更加容易。在放大過(guò)程中，不可能保持所有的參數(shù)恒定，因此，在保證某一參數(shù)恒定時(shí)，其他參數(shù)會(huì)有一定程度的折中。

表4　其他已商業(yè)化的一次性生物反應(yīng)器

典型的放大標(biāo)準(zhǔn)并不適用于波浪混合式一次性生物反應(yīng)器。波浪混合式一次性生物反應(yīng)器的放大主要依靠培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)以及對(duì)反應(yīng)器的了解程度進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)而實(shí)現(xiàn)放大。Pierce等分別利用WAVE20/50EH、WAVE 200和WAVE 1000生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)人視網(wǎng)膜細(xì)胞系P6A2生產(chǎn)AZIL2B蛋白，細(xì)胞系在不同大小反應(yīng)體系中以相似方式增殖和生產(chǎn)，只需調(diào)整工作體積，就可使系統(tǒng)成功從25 L放大到500 L［33］。

對(duì)于基于傳統(tǒng)不銹鋼材質(zhì)生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)的攪拌式一次性生物反應(yīng)器而言，其放大可依賴(lài)于已經(jīng)建立的典型的放大標(biāo)準(zhǔn)，如高徑比、P/VL、utip、混合時(shí)間，kLa等。因而，攪拌式一次性生物反應(yīng)器從實(shí)驗(yàn)室放大到生產(chǎn)規(guī)模相對(duì)于其他一次性生物反應(yīng)器較易。Dreher等利用BIOSTAT STR生物反應(yīng)器培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，嘗試了以P/VL、攪拌速度等作為放大標(biāo)準(zhǔn)對(duì)工藝進(jìn)行放大，發(fā)現(xiàn)以P/VL為放大標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行放大時(shí)效果最好，當(dāng)將培養(yǎng)體積從50 L放大到2 000 L，利用大泡通氣時(shí)，kLa達(dá)到23 1/h，利用微泡通氣時(shí)，kLa達(dá)到40 1/h［34］。

軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器的混合、通氣和功率輸入原理和搖瓶相似，因此將培養(yǎng)條件從搖瓶放大到軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器相對(duì)于放大到其他一次性生物反應(yīng)器更容易。在軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器中，由于kLa隨反應(yīng)器工作體積的增加而降低，因此，實(shí)現(xiàn)較高的氧傳遞速率（OTR）是成功放大的關(guān)鍵之一。Zhang等首次定量測(cè)定了軌道振搖式一次性生物反應(yīng)器的kLa，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)振蕩速度為39 r/m，工作體積為1 000 L時(shí)，回旋式振蕩一次性生物反應(yīng)器的kLa可達(dá)10 1/h，證明了CHO細(xì)胞培養(yǎng)體積可以放大至1 000 L［26］。

3　挑戰(zhàn)與展望

一次性生物反應(yīng)器的進(jìn)一步發(fā)展所面臨的主要挑戰(zhàn)為反應(yīng)器規(guī)模的限制以及膜的溶出物和析出物所帶來(lái)的問(wèn)題。目前一次性生物反應(yīng)器的最大規(guī)模為2 500 L，進(jìn)一步放大的主要限制因素是當(dāng)前應(yīng)用的一次性材料（如PVC，PVA和LDPE等）承受不了持續(xù)高壓。但隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)，細(xì)胞密度與產(chǎn)品表達(dá)濃度的成倍增加，可能小體積的生物反應(yīng)器就能達(dá)到生產(chǎn)規(guī)模。目前，GE公司正在開(kāi)發(fā)5 000 L一次性生物反應(yīng)器，預(yù)期其生產(chǎn)強(qiáng)度可與10 000～25 000 L的傳統(tǒng)生物反應(yīng)器相媲美。另外，近幾年，細(xì)胞治療技術(shù)在臨床治療中扮演著越來(lái)越重要的角色，為一些難治性的疾病提供了一種選擇，有時(shí)甚至是最后的選擇，顯示出了其不可替代的優(yōu)勢(shì)。而由于其個(gè)性化、個(gè)體化的特點(diǎn)，決定了較小的培養(yǎng)體積就能滿(mǎn)足生產(chǎn)要求，因此，一次性生物反應(yīng)器在生產(chǎn)規(guī)模方面的限制將會(huì)越來(lái)越小。用于細(xì)胞培養(yǎng)的一次性塑料袋和培養(yǎng)物接觸時(shí)可能會(huì)釋放溶出物，這些溶出物一旦進(jìn)入培養(yǎng)基中，將會(huì)阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)，而目前尚未有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法能適用于檢測(cè)不同膜的溶出物，因此，Eibl等提出了一種標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培育測(cè)試方法，即使用CHO XM 111-10細(xì)胞系結(jié)合ChoMaster? HP-1培養(yǎng)基（Cell Culture Technologies，Switzerland）測(cè)試膜的溶出物，可以及早確定在無(wú)蛋白及血清培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基（chemically defined culture media）中培育CHO細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)［35］。

其次，由于塑料材質(zhì)有限的熱交換能力以及相對(duì)于傳統(tǒng)不銹鋼反應(yīng)器較差的傳質(zhì)能力，一次性生物反應(yīng)器主要還是用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)于一些對(duì)傳質(zhì)要求較高的微生物，一次性生物反應(yīng)器的實(shí)際應(yīng)用較少，但其完全可用于對(duì)于氧需求較低的細(xì)菌和酵母等微生物的培養(yǎng)。而且如果能夠在細(xì)菌和酵母中實(shí)現(xiàn)對(duì)真核蛋白進(jìn)行正確的糖基化等翻譯后加工，一次性生物反應(yīng)器在微生物培養(yǎng)領(lǐng)域?qū)?huì)有更大的應(yīng)用空間［8］。目前市場(chǎng)上針對(duì)微生物培養(yǎng)開(kāi)發(fā)的一次性反應(yīng)器種類(lèi)越來(lái)越多，也暗示了其潛在的市場(chǎng)需求。

另外，以下問(wèn)題也不可忽視。首先，相對(duì)于傳統(tǒng)不銹鋼反應(yīng)器，一次性生物反應(yīng)器產(chǎn)生的液體廢物極少，但一次性材料丟棄后產(chǎn)生的固體廢物也不容忽視，目前尚未找到一種較好的方法來(lái)處理這些固體廢物。其次，由于一次性產(chǎn)品需要重復(fù)購(gòu)買(mǎi)，因此不僅要求供貨商提供可持續(xù)的供應(yīng)鏈，還要求用戶(hù)需要留出一定的空間來(lái)儲(chǔ)存這些一次性易耗品。再次，一次性傳感器的發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于一次性生物反應(yīng)器，其靈敏度較低，檢測(cè)范圍較窄。對(duì)于一些低附加值的生物產(chǎn)品而言，限制一次性生物反應(yīng)器應(yīng)用的主要原因是其成本問(wèn)題。隨著技術(shù)的發(fā)展，這些問(wèn)題將會(huì)得到解決。

近年來(lái)，全球已有超過(guò)50個(gè)單抗品種或項(xiàng)目使用一次性生物反應(yīng)器生產(chǎn)。一次性生物反應(yīng)器在西方國(guó)家已得到廣泛應(yīng)用，亞洲國(guó)家如中國(guó)雖然才剛剛起步，但已呈現(xiàn)出良好的發(fā)展趨勢(shì)。藥明康德公司已建成分別使用500 L和1 000 L一次性生物反應(yīng)器的兩條獨(dú)立細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)線(xiàn)，并于2013年在2 000 L一次性生物反應(yīng)器（Thermo Fisher Scientific）中成功復(fù)制了傳統(tǒng)不銹鋼生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝，使用NS0小鼠骨髓瘤細(xì)胞株完成了首批艾滋病治療單克隆抗體藥物ibalizumab（TMX-355）的試生產(chǎn)。此外，喜康生物醫(yī)藥、上海復(fù)宏漢霖生物技術(shù)有限公司等超過(guò)20家國(guó)內(nèi)生物醫(yī)藥企業(yè)也在使用一次性生物反應(yīng)器生產(chǎn)單抗類(lèi)產(chǎn)品?？梢?jiàn)，一次性生物反應(yīng)器將在生物制藥過(guò)程中得到更加廣泛的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Research progress in disposable bioreactor

WANG Yuanshan1，2，ZHU Xu1，2，NIU Kun1，2，XU Jianmiao1，2
（1.Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of Ministry of Education，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

The development，characteristics，applications and scale-up of disposable bioreactor were summarized in this review.The wave-mixed，stirred and orbital shaken disposable bioreactors were elaborated.The challenges and future prospects of disposable bioreactor were also discussed. Keywords：disposable bioreactor；development；characteristics；applications；scale-up

Q81

A

1674-2214（2015）03-0056-09

2015-05-21

國(guó)家級(jí)精品課程建設(shè)計(jì)劃；國(guó)家級(jí)精品資源共享課程建設(shè)計(jì)劃；浙江工業(yè)大學(xué)重點(diǎn)教材建設(shè)項(xiàng)目

王遠(yuǎn)山（1971—），男，安徽毫州人，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锎呋c生物轉(zhuǎn)化，E-mail：yuanshan@zjut. edu.cn.