環(huán)狀RNA生物特性與非小細胞型肺癌的研究進展

姜艷茹 李偉 陳余清

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科233000

通信作者：陳余清,Email:bbmccyq.@126.com

肺癌在全球和中國的癌癥相關死亡中位居首位。據估計,到2019年,肺癌死亡人數為142,670人,占癌癥相關死亡人數的24%[1],其中非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的83%。盡管近幾年,NSCLC在診斷及治療 (包括手術、放療和化療)方面取得了較大的進展,但大部分肺癌患者確診時已是晚期,總體5年生存率僅為21%[2],因此對于NCSLC 患者來說提高早期診斷效率和探索新的治療靶點非常重要。

隨著RNA 測序技術的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA (circular RNA,circRNA)在多種生物體內異常表達,其產生機制、結構特性及生物功能被學者們廣泛研究。目前,有學者提出circRNA 表達異常對改變腫瘤生物學特性具有較大的影響[3],使circRNA 成為當下研究的熱點。本文綜述了國內外相關報道,旨在闡明circRNA 的特征、生物功能及與NSCLC的關系,為進一步尋找NSCLC 新的生物標志物、診斷和治療的方法提供理論基礎。

1 circRNA的結構與特性概述

1.1 circRNA 的生物結構與類型 隨著生物技術及信息學的快速發(fā)展,大量的circRNA 被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于哺乳動物體內[4]。最初,由于其低豐度、結構特異性、功能未知等特點,circRNA 被認為是前m RNA (pre-m RNA)在剪接過程中的錯誤剪切或無功能的轉錄副產物[5]。但是進入21世紀后,研究者們發(fā)現(xiàn)circRNA 參與多種疾病 (如腫瘤、風濕系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、神經系統(tǒng)疾病等)的發(fā)生、發(fā)展過程。不同于線性RNA 的直接生成,circRNA 是通過非序列的pre-m RNA 反向剪切、連接成一個共價閉合環(huán)路結構[6]。

根據其起源,circRNA 主要分為以下4 類：外顯子circRNA、外顯子內含子circRNA、內含子circRNA 和來源于轉運RNA 的內含子circRNA[7]。其中外顯子circRNA起源于外顯子類型,占circRNA 的80%以上,環(huán)化形成機制主要包括以下3 種[8]： (1)套索驅動環(huán)化模型。pre-m RNA中不相鄰的外顯子相互靠近,形成由外顯子和內含子組成的套索中間體,其中內含子被剪切,外顯子的下游5'端剪接位點 (剪接供體)和上游3'端剪接位點 (剪接受體)相互鏈接形成外顯子circRNA;在某些特殊情況下,套索中間體中的內含子并不完全被剪切,被外顯子包圍保留下來,產生外顯子內含子circRNA[7]。 (2)內含子配對驅動環(huán)化模型。通過內含子側翼互補序列或反向重復序列的堿基對直接配對完成內含子配對驅動環(huán)化[7]。 (3)RNA 結合蛋白 (RNA binding protein,RBP)交聯(lián)配對驅動環(huán)化模型。該模型由2個側翼相互靠近的內含子反向互補序列引導形成 (如Alu 元素)[9]。此模型的形成需要RBP參與 (如MBL、QKI、hnRNP、絲氨酸/精氨酸蛋白等),可以結合線性pre-mRNA 序列上側向內含子的特定序列,將2個側向內含子連接在一起,進而促進成環(huán)和隨后的circRNA 生成;相反有些RBP阻礙circRNA 的形成,如腺苷脫氨酶通過直接結合和弱化RNA 雙鍵 (如反向Alu重復),減少腺苷轉肌苷過程,抑制circRNA 的形成,高表達腺苷脫氨酶破壞內含子堿基互補配對過程,減少premRNA 環(huán)化,降低circRNA 形成的可能性[10];同時有些RBP對circRNA 的生物發(fā)生既有正調控又有負調控作用(如FUS、hnRNPL)[11-12]。

內含子circRNA 是外顯子和內含子形成的套索中間體,擺脫了正常的去內含子分支及降解過程,遵循標準的pre-m RNA 剪接、修飾而形成的。來源于轉運RNA 的內含子circRNA 生物形成與tRNA-剪接核酸內切酶復合體相關,該復合體是由一種特定的內切酶和連接酶組成,它通過識別外顯子-內含子連接處序列切割位點進行切割,從而產生轉運RNA 的內含子circRNA[7]。

1.2 circRNA 的基本生物特性 由于circRNA 的生成機制與線性RNA 不同,因此其具有獨特的生物特性。 (1)豐富性：目前大量研究表明,在真核生物中有超過10萬個不同的circRNA[7];(2)穩(wěn)定性：circRNA 是閉合環(huán)狀結構,沒有5'-7甲基鳥嘌呤的帽結構和3'-腺苷酸尾結構不易被核酸外切酶降解[13],可在唾液、血液及外泌體中穩(wěn)定存在;(3)保守性：circRNA 在不同種族間具有高度保守性[14];(4)特異性：circRNA 在不同組織和不同發(fā)展階段的表達不同,具有細胞特異源性和組織特異源性[15]。這些特性可能使得circRNA 成為癌癥患者診斷、預后和治療反應的有效的生物標志物[16]。

2 circRNA的生物功能

2.1 circRNA 通過 “海綿”miRNA 調控基因的表達 circRNA 通過競爭性內源RNA 機制吸附miRNA,直接調節(jié)靶基因活性。競爭性內源RNA 包含miRNA 反應原件的轉錄物,通過競爭積極調節(jié)其他具有相同miRNA 反應原件的RNA 轉錄物,在m RNA 和ncRNA 之間形成了功能性的相互作用[7]。miRNA 是一類小ncRNA,它與靶向m RNA 的3'未翻譯區(qū)域互補位點結合,在轉錄后水平上調節(jié)m RNA 的表達,由此形成circRNA-miRNA-m RNA 軸,影響靶基因的轉錄后過程[17]。CDR1 as/ciRS-7是第1個被發(fā)現(xiàn)具有miRNA 海綿作用的circRNA,包含70 多個與miR-7結合的位點,可以顯著抑制miR-7 的活性,調節(jié)靶基因的活性,參與包括肺癌在內多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[18]。

2.2 circRNA 參與調節(jié)基因的轉錄和剪接過程 circRNA通過募集表觀遺傳調制器或轉錄因子來調控基因的表達。少數circRNA (circEIF3J、circPAIP2 等)定位于細胞核內,與RNA 聚合酶Ⅱ結合,作為miRNA 誘餌,通過UI Sn RNA/U1A/U1C復合物與5'端位點的內含子相互作用提高 轉 錄 效 率[19]。ci-ankrd52 是 來 源 于ankrd52 基 因 的circRNA,在ankrd52基因轉錄起始區(qū)大量富集,特異性結合親本基因ankrd52 主動轉錄的RNA 聚合酶Ⅱ,增強了ankrd52的轉錄效率,當ci-ankrd52敲除后,轉錄效率明顯降低,表明ci-ankrd52促進親本基因的轉錄[20]。

circRNA 與RBPs結合形成復合體,直接調節(jié)基因的轉錄及轉錄后水平。在人宮頸癌細胞中發(fā)現(xiàn)有大量circRNAs 與 HuR 蛋 白 結 合, 其 中 最 顯 著 的 是circPABPN1;實驗發(fā)現(xiàn),過表達circPABPN1使得Hu R 靶向的數種mRNA 表達量降低,最為顯著的是PABPN1 mRNA,進一步研究發(fā)現(xiàn)circPABPN1 與mPABPN1 競爭性結合 HuR,抑制mPABPN1 的翻譯從而發(fā)揮調控作用[21]。

此外,有研究表明circRNA 表達水平與某些基因剪接效率呈負相關性,其生物形成與pre-m RNA 剪接產生競爭關系,使mRNA 表達水平降低,表明在線性轉錄組和環(huán)狀轉錄組之間存在剪接機制競爭[21-22]。

2.3 circRNA 直接翻譯成多肽或蛋白質 研究表明,某些circRNA 可以直接翻譯成多肽或者蛋白質。不同于m RNA翻譯需要5'-7甲基鳥嘌呤的帽結構和3'-腺苷酸尾結構的參與,circRNA 上含有直接與核糖體結合的內部核糖體進入位點序列和特定的起始密碼子ATG,當真核細胞核糖體40S和circRNA 結合,circRNA 作為模板起翻譯作用,并且人體細胞中circRNA 的翻譯是通過滾動循環(huán)放大過程實現(xiàn),不需要傳統(tǒng)的翻譯所需元素[23]。Yang等[23]發(fā)現(xiàn),在人體細胞中N6-甲基化驅動的circRNA 轉譯普遍存在;Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)一種含有內部核糖體進入位點驅動的開放閱讀框序列circRNA (circ-SHPRH),直接編碼蛋白質SHPRH-146aa,并且兩者在膠質母細胞瘤中的表達均是減少的,機制上泛素化的SHPRH 序列使增殖細胞核抗原成為E3連接酶,而SHPRH-146aa使全長SHPRH 不被泛素蛋白酶體降解,抑制細胞增殖和致瘤性。

3 circRNA與NSCLC的相關研究

3.1 circRNA 與NSCLC 發(fā)生、發(fā)展的關系 circ-ITCH是首先被報道的在肺癌組織中異常表達的circRNA,它通過結合miR-7和miR-214上調ITCH 的表達,降低Wnt/β蛋白通路的活性,抑制肺癌細胞的增殖[25]。目前被廣泛研究的circRNA-CDR1as(又稱ciRS-7),它包含了超過70個與miRNA 結合的位點,Yan等[26]發(fā)現(xiàn)CDR1as在NSCLC患者癌組織較癌旁組織中表達上調,與患者TNM 分期、總體生存期、臨床病理參數相關,并且發(fā)現(xiàn)CDR1as的表達水平是NSCLC患者預后的獨立因素。機制上CDR1as作為 “海綿”吸附miR-7,上調miR-7 的靶基因EGFR、CCNE1和PKI3CD 的表達,促進肺腫瘤的生長與增殖。

Chen等[27]對正常支氣管上皮細胞系 (16 HBE)和惡性轉化細胞系 (16HBE-t)行circ RNA 芯片分析,結果發(fā)現(xiàn)與16HBE 比較,16HBE-t中circRNA100146 的表達最為顯著,并且在NSCLC 組織和細胞系中行逆轉錄實時定量PCR 進一步驗證,其表達水平在組織及細胞中均升高。通過繪制受試者工作特征曲線,結果示circRNA100146具有診斷NSCLC 潛在的能力。相關體內外實驗表明,減少circRNA100146表達降低了癌細胞的增殖和侵襲能力、促進癌細胞凋亡,并且可與多種剪接因子家族SF3、miR-361-3p 和 miR-615-5p 結合,直接影響下游多種包括NFAT5、COL1A1、TRAF3 和MEF2C 在內的m RNA 的表達,促進肺癌的發(fā)生、發(fā)展。

在Wei等[28]研究中發(fā)現(xiàn)circPTPRA 較癌旁組織和支氣管上皮細胞株在NSCLC組織和細胞株中表達顯著降低,其表達水平與淋巴結轉移密切相關,總體生存期較高表達組更短;在H23和H1755細胞株中敲除circPTPRA,E-鈣粘蛋白表達水平降低、N-鈣粘素和波形蛋白表達水平升高,增強了腫瘤細胞的增殖和侵襲能力,并且實驗表明circPTPRA 是通過結合miR-96-5p調節(jié)上皮間質細胞的轉化,上調下游腫瘤抑制因子RASSF8,進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

基于circRNA 特殊的生物結構,使得其能夠穩(wěn)定的存在于人的唾液、血液及外泌體中[16];Hang等[29]在NSCLC患者血漿中發(fā)現(xiàn)circFARSA 表達顯著上調,對50 例NSCLC 患者和健康正常人血漿中circ FARSA 和FARSA m RNA 行逆轉錄實時定量PCR 驗證,發(fā)現(xiàn)在NSCLC 患者血漿中circFARSA 高表達,而FARSA m RNA 幾乎測不到;受試者工作特征曲線下面積為0.71,表明血漿中的circFARSA 可作為診斷NSCLC 潛在生物標志物;體外構建過表達circFARSA 載體,發(fā)現(xiàn)可增強細胞轉移和侵襲能力,生物信息學分析提示circ FARSA 可能與miR-330-5p、miR-326、miR-1178-3p、miR-620和miR-1270相結合,可能參與多種癌癥相關途徑,其中miR-330-5p和miR-326可能直接與脂肪酸合成酶相互作用,脂肪酸合成酶作為一種致癌基因出現(xiàn)在各種腫瘤中,從而促進肺癌的發(fā)生、發(fā)展。

3.2 circRNA 在NSCLC 預后與診療方面的應用 circ_0003645在NSCLC 組織和細胞系中表達上調,表達水平與TNM 分期密切相關。通過海綿miR-1179 調控TMEM/4A 的表達,相當于原癌基因的作用促進癌細胞生長與轉移且抑制癌細胞凋亡,并且高表達組比低表達組患者總體生存率低,表明circ_0003645是NSCLC 患者的獨立預后因素[30]。由此可見,circ_0003645不僅參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展,而且可以作為預測NSCLC 患者預后的良好指標。

在Liu等[31]的實驗中發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0005962在肺腺癌細胞系和肺腺癌患者血漿中表達均增高,其受試者工作特征曲線下面積為0.73,表明hsa_circ_0005962可作為診斷肺腺癌的生物標志物;對術前和術后肺腺癌患者血漿中hsa_circ_0005962表達量進行測定,發(fā)現(xiàn)術后肺腺癌患者血漿中hsa_circ_0005962的表達量明顯低于術前,若沉默其表達可能對治療肺腺癌具有重要意義。circPRKCI是來源于染色體3q26.2擴增,在肺腺癌組織中高表達,通過結合miR-545和miR-589,消除了轉錄因子E2F7對腫瘤的抑制作用,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[31-32];在異種移植模型中腫瘤內注射以circPRKCI為靶點的siRNA,抑制了腫瘤的生長、增殖,這為肺腺癌分子靶向治療提供理論基礎。

circ_0016760在NSCLC 組織和細胞系中表達顯著上調,結合miR-1287 調節(jié)GAGE1 的表達,促進癌細胞增殖、轉移、侵襲,抑制癌細胞凋亡,過表達miR-1287或沉默GAGE1可部分抑制circ_0016760表達引起的細胞增殖、侵襲能力[33]。動物實驗發(fā)現(xiàn),沉默circ_0016760表達組小鼠體內腫瘤體積較小。綜上表明,circ_0016760/miR-1287/GAGE_1調節(jié)信號參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展,可作為NSCLC治療的理想靶點。

Qu等[32]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0020123在臨床NSCLC 患者組織中顯著高表達,通過生存曲線分析發(fā)現(xiàn)高表達hsa_circ_0020123組的患者總體生存時間縮短,表明其可作為判斷NSCLC預后的潛在生物標志物;進一步將A549細胞株中hsa_circ_0020123的表達沉默,其增殖、侵襲和轉移能力明顯減弱, 凋亡能力增強, 將沉默hsa_circ_0020123表達的A549細胞注入小鼠皮下,發(fā)現(xiàn)小鼠體內的腫塊重量較對照組明顯減少;機制上hsa_circ_0020123通過結合miR-144 上調ZEB1 和ZEH2的表達促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,這對判斷NSCLC 患者預后和后續(xù)治療提供了新的靶點及理論基礎。

4 總結和展望

細胞內存在大量的circRNA,廣泛參與了體內絕大多數重要的生物學過程,它獨特的多層次調控為探明許多復雜疾病的發(fā)病機制提供了新思路。目前,研究者們發(fā)現(xiàn)大量circRNA 在NSCLC 中異常表達可能參與NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展,并且可作為NSCLC 診斷和判斷預后的潛在生物標志物,為治療提供新的理想靶點。但是,目前大部分研究者僅僅是通過生物信息學的方法預測circRNA 可能在NSCLC中發(fā)揮的作用,并且絕大多數的circRNA 是作為競爭性內源RNA 在被研究,競爭性內源RNA 內源性競爭機制極其復雜,其調控網絡需納入更多的因子 (如m RNA、蛋白等)來豐富和完善,進一步深入研究circRNA 在NSCLC發(fā)病機制和調控途徑中的作用,有助于為肺癌的診斷和精準治療開辟新的途徑?？傮w來說,circRNA 在NSCLC中研究前景是可期待的。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突