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    植物病原菌多聚半乳糖醛酸酶的研究簡(jiǎn)述

    2020-03-02 22:38:12張小秋宋修鵬陳冠州王澤平雷敬超梁永檢李楊瑞黃冬梅顏梅新
    廣西糖業(yè) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:醛酸細(xì)胞壁半乳糖

    張小秋,宋修鵬,陳冠州,王澤平,雷敬超,梁永檢,李楊瑞,黃冬梅,顏梅新

    (1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530007;2.廣西北海市蔬菜研究所,廣西 北海 536000;3.廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,廣西 崇左 532415)

    植物細(xì)胞壁是抵御病原菌入侵的主要屏障。病原菌通過(guò)分泌一系列的細(xì)胞壁降解酶降解寄主植物的細(xì)胞壁,以突破屏障入侵寄主植物[1]。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG;EC 3.2.1.15)是一種重要的細(xì)胞壁降解酶,廣泛存在于細(xì)菌、真菌和植物中。PG通過(guò)降解植物細(xì)胞壁中的同源多聚半乳糖醛酸,使植物組織浸解,導(dǎo)致原生質(zhì)體死亡,在病原菌侵染寄主引起病癥過(guò)程中有著關(guān)鍵作用。PG是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白,首次從致病真菌的離體細(xì)胞壁中獲得,作用是催化果膠α-(1,4)多聚半乳糖醛酸的裂解[2]。

    1 PG的分類與特征

    PG是降解植物果膠骨架結(jié)構(gòu)的主要酶之一。根據(jù)底物位置的不同,PGs可分為內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)、外切多聚半乳糖醛酸酶(exo-PG)或鼠李糖半乳糖苷酶(olio-PG)。endo-PG能隨機(jī)地從多聚半乳糖醛酸鏈內(nèi)部消解α-1,4-糖苷鍵,產(chǎn)生聚合度為10-14的寡居半乳糖醛酸,對(duì)底物特異性較強(qiáng)。exo-PG能從寡聚半乳糖醛酸鏈的非還原末端消除單個(gè)半乳糖醛酸,產(chǎn)生聚合度逐步降低的寡聚半乳糖醛酸鏈和半乳糖醛酸單體,對(duì)底物特異性較弱[3]。endo-PG可降解細(xì)胞組織引起細(xì)胞死亡[4],且產(chǎn)生的寡居半乳糖醛酸是激發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)的激發(fā)子[5]。exo-PG可降解由endo-PG產(chǎn)生的激發(fā)子物質(zhì),并轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌?xì)胞壁降解酶的誘導(dǎo)劑[6]。有學(xué)者認(rèn)為復(fù)雜的endo-PG形式可能使病原菌增加降解效率、擴(kuò)大寄主范圍的能力[7]。

    不同來(lái)源的PG序列具有很大的差異。細(xì)菌PG之間的相似性很低,但Erwinia carotovora病原菌中的兩個(gè)endo-PG具有95.5%的相似性,其余序列間的相似性為11.7%~58.7%。相同作用方式的PG序列的相似性高于不同作用方式的PG序列。細(xì)菌exdo-PG間的相似性為29.1%~58.7%,endo-PG間的相似性為39.3%~95.5%。另外,同一物種不同作用方式的PG間的相似性也很低[8]。真菌PG序列之間具有較高的相似性,相似性大小范圍在11.3%~100%,同一類型PG之間相似性較高,不同類型之間相似性很低,一般在10%~20%之間。真菌PG有多個(gè)完全保守的芳香族的氨基酸殘基,endo-PG和exo-PG還有各自特異保守片段和殘基[8,9]。據(jù)報(bào)道,PG的進(jìn)化源于生態(tài)對(duì)策,是與植物的免疫反應(yīng)協(xié)同進(jìn)化的[10]。

    多數(shù)真菌的PG是多基因編碼的[11],ORF編碼區(qū)被內(nèi)含子分隔,內(nèi)含子最多可達(dá)7個(gè)。PG的前體蛋白N端信號(hào)肽一般為 7~16AA,個(gè)別如曲霉菌的PGC有一個(gè)較長(zhǎng)的N端信號(hào)肽(40AA)。大多數(shù)真菌PG的分子量為20~60 kDa,等電點(diǎn)偏酸性[12]。

    2 PG活性及致病性

    不同病原菌的PG的理化性質(zhì)不同。小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)PG在pH4~12范圍內(nèi)均具有活性,pH6.0時(shí)活性最大;對(duì)熱不穩(wěn)定及對(duì)胰蛋白酶和蛋白酶K敏感,對(duì)紫外線和氯仿亦敏感[13]。蟠桃褐腐病原菌(Monilinia fructicola)PG在28℃條件下活力最高,在pH 7.0時(shí)活性達(dá)到最高,培養(yǎng)5 d時(shí)的酶活力最高[14]。水稻病菌(Rhizoctonia solani)PG的產(chǎn)生受培養(yǎng)時(shí)間、溫度、碳源、葡萄糖濃度和pH的影響,其活性受緩沖液pH和溫度的影響。葡萄糖是PG的最適碳源,但葡萄糖濃度大于5%時(shí),PG的產(chǎn)生受到抑制。當(dāng)緩沖液50℃,pH5.0時(shí),PG活性最高。PG遇強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、氯仿、高熱、紫外線、胰蛋白酶和蛋白酶K等均不穩(wěn)定[15]。

    PG是病原菌定殖寄主與產(chǎn)生致病性的必需因子。Jurick等[16]發(fā)現(xiàn)氯氮卓青霉菌(Penicillium solitum)PG在其侵染寄主的前期有著重要的作用;Li等[17]在畢赤酵母中表達(dá)辣椒疫霉(P.capsici)的PG體外重組蛋白,發(fā)現(xiàn)重組蛋白能侵染辣椒表現(xiàn)癥狀;Isshiki等[18]研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌(Alternaria citr)endo-PG的突變降低了病原菌對(duì)柑橘和馬鈴薯的致病力?;移咸焰呷笔cpg1后,其在不同寄主上的致病力下降[19],麥角菌(Claviceps purpurea)endo-PG失活后,幾乎喪失了對(duì)黑麥的致病力[20],說(shuō)明PG在病原菌產(chǎn)生致病力中起到重要作用。

    PG活性對(duì)病原菌的致病力有影響。孫文秀[21]研究了大豆疫酶根腐病菌(Phytophthora sojae)中的PG活性對(duì)其致病力的影響,發(fā)現(xiàn)致病性菌株的PG活性明顯高于非致病菌株的。王麒然等[22]測(cè)定了花生葉腐病菌(Rhizoctonia solani Kühn)離體條件下和活體內(nèi)病菌分泌的細(xì)胞壁降解酶活性與變化,發(fā)現(xiàn)果膠酶中的PG酶活性強(qiáng),感病花生品種中測(cè)得的細(xì)胞壁降解酶活性一般都比抗病品種高。蓮腐敗病菌在侵染寄主過(guò)程中可產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶,以PG活性最高,且強(qiáng)致病性菌株的PG活性顯著高于弱致病性菌株[23]。李萍等[24]也發(fā)現(xiàn)PG活性的高低與辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)致病力的強(qiáng)弱相關(guān),試驗(yàn)菌株接種辣椒苗復(fù)壯后的PG活性高于復(fù)壯前;強(qiáng)致病力菌株的PG活性明顯高于弱致病力菌株。崔佳等[25]構(gòu)建了玉米彎孢葉斑病菌(Curvularia lunata)Clpg1基因敲除突變體ΔClpg1,發(fā)現(xiàn)ΔClpg1突變體的PG活性降低,致病力減弱,說(shuō)明Clpg1基因調(diào)控了玉米彎孢葉斑病菌的致病性。

    PG的糖基化位點(diǎn)與其致病性有重要作用。通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PG的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有不同數(shù)量和類型的可能N-糖基化位點(diǎn)。李艷青等[26]突變了辣椒疫霉(P.capsici)PCIPG2 N-糖基化的3個(gè)潛在位點(diǎn)(N34、N76、N137),并表達(dá)了這些突變蛋白及測(cè)定其活性,發(fā)現(xiàn)N-糖基化在PCIPG2酶活性上起直接作用,使得PCIPG2酶在較低水平上保持較高的穩(wěn)定性。單個(gè)的PCIPG2糖基化位點(diǎn)N34、N76、N137 對(duì)PCIPG2的致病性起正調(diào)控作用,而3個(gè)糖基化位點(diǎn)相互協(xié)調(diào)的功能抑制PCIPG2的活性,在PCIPG2表達(dá)致病過(guò)程中起負(fù)調(diào)控。曲霉(Aspergillus spp.)和寄生疫霉(P.parasitica)的PG利用N-糖苷酶F去糖基化后分子量降低,蛋白酶活性完全喪失[27,28]。

    3 PG的表達(dá)調(diào)控

    大多數(shù)真菌的PG屬于分泌型胞外酶,有誘導(dǎo)物存在時(shí)才能分泌PG,果膠、聚半乳糖醛酸等均能誘導(dǎo)PG的分泌。但葡萄糖、Ca2+、PG抑制蛋白(PGIP)則抑制PG的分泌[29]。Aspergillus glavus的PG基因在含果膠培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達(dá),而葡萄糖卻不能誘導(dǎo)其表達(dá)。Colletotrichum lindemuthianum侵染寄主后,其PG的轉(zhuǎn)錄活性迅速上升[30]。香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)生理小種4和生理小種1在柑桔果膠或PGA提供碳源時(shí),PG活性加強(qiáng),以葡萄糖或CMC作為唯一碳源時(shí),PG活性很低[31]。核盤菌(Sclerotinia.Sclerotio-rum)在1%橘皮果膠培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達(dá),PG活性不斷提高,并在第7d活性達(dá)到最高[32]。PG基因可能與同家族內(nèi)其他基因協(xié)同作用。許春景等[33]通過(guò)基因敲除技術(shù),研究發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能與同家族內(nèi)其他基因協(xié)同作用,通過(guò)調(diào)節(jié)果膠酶活性參與蘋果樹腐爛病菌致病過(guò)程。

    4 PG基因的克隆表達(dá)

    目前克隆表達(dá)了多種病原菌的PG基因。GarciaMaceira等[34]從番茄?;虵.oxysporum.f.sp.lycopersici(FOL)中克隆了pg5基因,推測(cè)其氨基酸為35 kDa,pI 8.3,過(guò)表達(dá)獲得35 kDa具有活性的PG蛋白。李洋等[35]利用同源克隆技術(shù)克隆了馬鈴薯軟腐?。‥rwinia carotovora subsp.carotovora)peh基因,在原核表達(dá)中表達(dá)并測(cè)定得到其酶活性0.024 U·mL-1·min-1。趙艷琴等[36]克隆了煙草靶斑病菌的endo-PG1和endo-PG2的cDNA全長(zhǎng),序列分析表明endo-PG1和endo-PG2的推測(cè)蛋白均具有PLNO3003基因家族保守結(jié)構(gòu)域,其跨膜結(jié)構(gòu)間存在差異,表達(dá)受與煙草互作的誘導(dǎo)。吳偉懷等[37]首次從劍麻斑馬紋病菌中獲得了5個(gè)PG基因,并分別命名為Szpg1~Szpg5,均存在于被檢測(cè)的劍麻斑馬紋病菌中。龔鑫等[38]利用RT·PCR結(jié)合RACE方法克隆了蓮腐敗病菌的pg1全長(zhǎng)cDNA,獲得一個(gè)編碼371個(gè)氨基酸的完整開放閱讀框。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建了PG1同工酶的真核表達(dá)載體,經(jīng)甲醇誘導(dǎo)分泌出胞外蛋白PG1,分子量大小約為38kDa。 由書妍等[39]表達(dá)了柑橘綠霉病菌(Penicillium digitatum)的PdPG2基因,PdPG2基因是酸性表達(dá)基因,其表達(dá)量隨著pH升高而降低,pH3.0時(shí)表達(dá)量提高至對(duì)照的10倍,pH8.0時(shí)表達(dá)量下降至對(duì)照的0.36倍。劉震等[40]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了玉米彎孢葉斑病菌PG基因(Clpg)在病原菌-寄主植物互作時(shí)期的表達(dá)情況,鑒定獲得Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4基因,Clpg1基因的表達(dá)先升高后下降,Clpg2、Clpg3和Clpg4基因的表達(dá)逐漸上升。

    5 PG活性的抑制

    PG活性受到多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPS)的抑制。PGIPS是病原真菌分泌的endo-PG的抑制劑。病原菌侵染過(guò)程中上調(diào)表達(dá)endo-PG基因,在某一階段降解植物細(xì)胞壁以獲取營(yíng)養(yǎng)供自身營(yíng)養(yǎng)[41]。為了抵御病原菌的PG,植物產(chǎn)生PGIPS與PG互作,過(guò)量表達(dá)的PGIPs激活茉莉酸代謝和β-1,3-葡聚糖酶表達(dá),抑制水楊酸表達(dá),引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄重組和防御代謝等合成表達(dá),以抵御病原菌的入侵[42]。PGIP富含亮氨酸,與PG酶非競(jìng)爭(zhēng)性地、特異性地結(jié)合,以抑制PG酶的活性,提高植物的抗病性。

    PGIP的含量、分布差異與植物的抗病性有關(guān)。PGIP可能更多地在植物生長(zhǎng)的幼苗期對(duì)病原真菌起防御作用。阮期平等[43]測(cè)定小麥品種的抗赤霉病性與PGIP含量和分布的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)小麥品種對(duì)赤霉病的抗性越強(qiáng),PGIP含量越高、分布越廣;噴灑小麥禾谷鐮于SW89-2589小麥品種的幼苗上,發(fā)現(xiàn)葉感病較為嚴(yán)重,其次是根,莖幾乎不感病,PGIP在莖中的含量最高,其次是根,葉中最少;比較了抗病性不同的2個(gè)小麥品種,發(fā)現(xiàn)感病品種的PGIP含量較少,抗性較強(qiáng)的品種的PGIP含量較高。

    PG活性受到兒茶素、酶類物質(zhì)、韭菜汁、NO等的影響。研究表明兒茶素在棉苗對(duì)枯萎病抗性中的作用時(shí),發(fā)現(xiàn)兒茶素可抑制枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā) ,對(duì)培養(yǎng)液中病菌的PG有抑制作用[44]。酚類物質(zhì)對(duì)哈密瓜兩種主要致腐病原產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、對(duì)羥基苯甲酸丁酯均能明顯地降低匍枝根霉和半裸鐮刀菌產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶,對(duì)這些酶的活性也有明顯的抑制作用[45]。楊靜美等[46]測(cè)定了不同濃度的韭菜汁對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的PG影響,發(fā)現(xiàn)韭菜汁液濃度的增加對(duì)PG活性的抑制作用增強(qiáng)。吳斌等[47]研究發(fā)現(xiàn),NO能抑制香蕉果實(shí)中PG的活性。

    6 結(jié)語(yǔ)

    植物病原真菌PG的種類、分子進(jìn)化、基因特征分子生物學(xué)等特征得到了較為深入的研究,但植物病原細(xì)菌的PG研究較真菌PG少,且PG的致病性機(jī)制及其在致病過(guò)程中與寄主間的互作有待深入研究。

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