γ-干擾素釋放試驗假陰性影響因素研究進展

孫丹雄

云南省第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,昆明650000

γ-干 擾 素 釋 放 試 驗 (interferon-γ release assays,IGRA)通過早期分泌抗原靶 (ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)等特異性抗原 (有些產品還增加了TB7.7抗原多肽),體外刺激機體特異性效應T 淋巴細胞,然后檢測γ-干擾素 (interfer on-γ,IFN-γ)水平或計數(shù)分泌IFN-γ的特異性T 淋巴細胞,從而判斷是否存在結核感染。檢測方法主要有兩種： (1)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IFN-γ水平,商業(yè)產品主要是澳大利亞Cellestis 公司的QFT-GIT (Quanti FERON-TB Gold In-Tube)、QFT-G(QuantiFERON-TB Gold)以及QFT (QuantiFERON-TB)。(2)采用酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測并計數(shù)分泌IFN-γ的特異性T 淋巴細胞,商業(yè)產品主要是英國牛津Immunotech公司生產的T-SPOT.TB。ESAT-6 和CFP-10 主要存在于結核桿菌復合群,在卡介苗和大多數(shù)非結核分枝桿菌中缺失,所以IGRA 診斷結核感染的特異度明顯高于PPD 試驗,但是其不能區(qū)分活動性結核和潛伏性結核感染。有研究顯示,在中、低收入國家以及結核病高負擔地區(qū)不建議使用IGRA 來診斷活動性結核病。國內進行的一項大規(guī)模、多中心、回顧性研究顯示,IGRA 診斷活動性肺結核的特異度僅為56.37%,在沒有肺結核的肺病患者中T-SPOT.TB的陽性率高達43.6%。由此可見,在結核病高負擔國家,IGRA 的臨床價值更在于利用其陰性結果并結合其他臨床表現(xiàn)來進一步排除活動性結核感染。但諸多研究顯示,很多因素會造成IGRA 假陰性[1-2],臨床上應注意綜合分析。本文就IGRA 假陰性的原因及相關機制作一綜述。

1 患者的全身狀態(tài)

1.1 年齡 大多數(shù)研究均顯示,年齡是IGRA 假陰性的獨立影響因素,特別是對于成年人,隨著年齡的增長,假陰性逐漸增多。歐洲肺結核網(wǎng)絡實驗小組進行了一項國際多中心橫斷面回顧性研究 (TBNET 研究)[3],來自25 個研究中心的664例經結核桿菌培養(yǎng)和/或結核桿菌特異性核酸檢測確診的活動性結核病患者納入分析,Logistic回歸分析顯示,年齡是QFT-GIT 假陰性的唯一顯著變量 (OR=1.04,95%CI：1.02～1.07,P<0.01)。其機制可能是隨著年齡增長,ESAT-6或CFP-10引起的IFN-γ濃度逐漸減少,從而出現(xiàn)假陰性。在兒童患者中,年齡與假陰性的關系不明確。有學者研究發(fā)現(xiàn)年輕兒童的IGRA 假陰性結果發(fā)生率更高[4],但Velasco-Arnaiz等[5]的研究則顯示對于5歲以下的兒童,年齡與抗原刺激引起的IFN-γ反應之間沒有相關性。

1.2 營養(yǎng)狀態(tài) 有研究顯示,體質量指數(shù)過高、過低均與IGRA 假陰性相關。Matsushita等[6]研究發(fā)現(xiàn)低體質量指數(shù)在假陰性QFT-IT 患者中更常見。Hang等[7]研究顯示消瘦 (體質量指數(shù)<16.0 kg/m2)與IGRA 假陰性顯著相關(OR=5.42,95%CI：1.48～19.79)。Pan 等[8]的研究則顯示超重 (體質量指數(shù)≥25 kg/m2,OR=2.43,95%CI：1.05～5.63)是假陰性T-SPOT.TB的獨立危險因素。國內有研究發(fā)現(xiàn)低蛋白血癥對IGRA 的檢測結果沒有影響[9]。營養(yǎng)狀態(tài)與IGRA 假陰性的關系及相關機制有待進一步研究。

1.3 等位基因和種族 少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)等位基因和種族與IGRA 假陰性相關。Hang等[7]對543例新診斷的涂片陽性肺結核患者進行研究,Logistic回歸分析顯示,患者所攜帶的HLA-DRB1*0701等位基因數(shù)目增加與QFT-GIT 假陰性顯著相關 (OR=5.09,95%CI：2.31～11.22),其機制可能是HLA-DRB1*0701等位基因的遺傳變異性可引起ESAT-6和CFP-10的結合減少,當抗原較少提呈給T 細胞時,可能會出現(xiàn)免疫反應失效,IFN-γ 濃度減少。Matsushita等[6]在后來的研究中也發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*0701等位基因在QFT-GIT 假陰性的肺結核患者中更常見。Nguyen等[10]對1 527例培養(yǎng)確診的結核病患者進行研究,多變量分析顯示非西班牙裔白人/種族與IGRA (包括QFT-GIT 及T-SPOT.TB)假陰性相關。

2 基礎疾病與免疫功能

2.1 人類免疫缺陷病毒 (hu man i mmunodeficiency vir us,HIV)感染 諸多研究發(fā)現(xiàn)HIV 感染與IGRA 假陰性密切相關,HIV 陽性患者的敏感度顯著降低。Hang等[7]研究顯示合并HIV感染是IGRA假陰性的獨立危險因素(OR=6.38,95%CI：1.78～22.92)。HIV 患者假陰性結果增加可能與其低水平的CD4+T 淋巴細胞計數(shù)有關[11-12]。

2.2 糖尿病 目前,糖尿病與IGRA 假陰性的關系仍不明確。有學者研究發(fā)現(xiàn)嚴重的糖尿病會導致IGRA 假陰性,空腹血糖水平升高與結核桿菌特異性IFN-γ 水平呈負相關[12-13]。但 也 有 研 究 顯 示, 不 管 是 QFT-IT 還 是T-SPOT.TB,糖尿病均與假陰性無關[14]。國內學者Yang等[15]進行的研究也顯示糖尿病不是假陰性T-SPOT.TB檢測結果的顯著預測因素。

2.3 惡性腫瘤 惡性腫瘤與IGRA 假陰性的關系亦不明確。Kwon等[16]進行一項多中心回顧性隊列研究顯示,合并惡性腫瘤與QFT-GIT 假陰性顯著相關 (OR=2.42,95%CI：1.30～4.49)。但國內學者Yang等[15]進行的大樣本回顧性研究則顯示,合并惡性腫瘤不是T-SPOT-TB假陰性結果的顯著預測因素。

2.4 淋巴細胞 很多研究發(fā)現(xiàn)IGRA 受CD4+T 細胞免疫缺陷的影響[17]。Kwon 等[16]研究發(fā)現(xiàn),QFT-GIT 假陰性結果與淋巴細胞高度相關 (淋巴細胞總數(shù)<1.0×109/L,OR=1.86,95%CI：1.21～2.87)。但在Syed Aha med Kabeer等[18]的研究中,Logistic回歸分析顯示QFT-G 假陰性與CD4+T 淋巴細胞計數(shù)無關,不過在CD4+計數(shù)<200個/μl的個體中更容易出現(xiàn)不確定結果。淋巴細胞與IGRA 假陰性的關系爭議頗多,有待進一步研究,國內學者Yang等[15]進行的大樣本研究也顯示,T-SPOT.TB假陰性與CD4+T 淋巴細胞計數(shù)及血淋巴細胞絕對值均無關系。

2.5 藥物 影響機體免疫功能的藥物可能會導致IGRA 假陰性。Keystone等[19]研究發(fā)現(xiàn),炎癥性疾病 (類風濕關節(jié)炎、脊柱炎或克羅恩病)患者經過14周抗腫瘤壞死因子α治療及CFP-10 刺激后,既往患肺結核的患者釋放IFN-γ的CD4+T 淋巴細胞減少。Lai等[20]研究發(fā)現(xiàn),類固醇的使用在假陰性IGRA 患者中更常見。

目前,基礎疾病及免疫功能低下與IGRA 假陰性的關系仍不明確。在TBNET 研究[3]中,免疫功能低下 (至少存在以下一種：HIV 感染,免疫抑制藥物治療,糖尿病,類風濕性關節(jié)炎,惡性腫瘤和/或實體器官或干細胞移植史)不是假陰性IGRA (包括QFT-GIT 及T-SPOT.TB)的危險因素。

3 炎癥指標

Kwon等[16]研究發(fā)現(xiàn)C-反應蛋白是QFT-GIT 假陰性結果的預測因素,且QFT-GIT 假陰性和不確定結果的概率隨著C-反應蛋白水平的升高而增加。但Yang等[15]的研究則顯示C-反應蛋白、ESR 等均與T-SPOT.TB假陰性無關。炎癥指標在IGRA 假陰性中的預測價值有待商榷。

4 結核病情

4.1 病程 結核病的病程與IGRA 假陰性可能有關。Pan等[8]對肺結核進行研究,多變量分析顯示,患者住院前的較長病程 (>6個月,OR=2.46,95%CI：1.24～4.92)是假陰性T-SPOT.TB的獨立危險因素。

4.2 痰菌情況 痰菌陰性的患者可能更容易出現(xiàn)IGRA 假陰性。國內學者Yang等[15]對4 964例患者 (2 425例活動性結核病,2 539例非結核病呼吸道疾病)進行回顧性研究,Logistic回歸分析顯示痰抗酸桿菌涂片陰性 (OR=1.821,95%CI：1.338～2.477)、分枝桿菌培養(yǎng)陰性 (OR=1.379,95%CI：1.043～1.824)與T-SPOT.TB假陰性增加有關,機制不詳。

4.3 合并肺外結核 國內學者Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn),未合并肺外結核會增加T-SPOT.TB的假陰性 (OR=1.291,95%CI：1.026～1.623)。但Syed Aha med Kabeer等[18]的研究則顯示,與肺結核相比,肺外結核患者QFT-G 的敏感度并不遜色。TBNET 研究[3]也顯示,肺外結核不是假陰性IGRA 的影響因素。由此可見,肺外結核并不一定會增加IGRA 假陰性發(fā)生率。

4.4 肺結核病變范圍 肺結核的病變范圍與IGRA 假陰性可能有一定關系。Kwon等[16]進行一項多中心回顧性隊列研究,1 264例培養(yǎng)確診的成年結核病患者納入研究,胸部影像學顯示雙側病變 (OR=1.75,95%CI：1.13～2.72)與QFT-GIT 假陰性顯著相關。

4.5 結核的治療情況 抗結核治療病情好轉,部分患者IGRA 結果會出現(xiàn)轉陰的情況。有研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ的定量水平在治療期間逐漸下降,特別是在活動性結核病中,其機制不詳,可能與抗原負荷減少有關[21]。Lee等[22]對59例免疫功能正常的新診斷為活動性結核病的士兵進行研究,抗結核治療前以及治療后的第1、3、6個月QFT-GIT 的陽性率分別為96.6%、89.8%、71.2%、66.1%,IFN-γ 水平則分別為 (5.31±5.34)、 (3.95±4.30)、 (1.82±2.14)、(1.50±2.12)IU/ml,均隨著治療時間的延長而逐漸降低。Par k等[23]研究發(fā)現(xiàn),抗結核治療后T-SPOT.TB定量分析結果顯著下降。抗結核治療與IGRA 結果的關系比較復雜,具體的影響情況尚不清楚,目前爭議較多。有學者報道,兒童患者在治療的第1個月中表現(xiàn)為對ESAT-6的反應增加,隨后對ESAT-6 和CFP-10 的反應逐漸減少[24]。在Matsushita等[6]的研究中,19例QFT-IT 陰性的肺結核患者 (涂片陽性或經培養(yǎng)證實)中有8例在抗結核治療后 (第2個月或第7個月)反而轉為陽性。TBNET 研究[3]則顯示,抗結核治療不是假陰性IGRA 試驗結果的危險因素。國內也有研究顯示,結核化療不是導致治療前后IFN-γ水平變化的主要原因[25]。

5 檢測方法及影響因素

5.1 檢測方法 檢測方法與IGRA 假陰性可能也有一定關系,但爭議頗多。Lai等[20]等研究發(fā)現(xiàn),與T-SPOT.TB相比,QFT-GIT 更容易導致假陰性和不確定結果,尤其是在免疫功能低下的患者中 (惡性腫瘤、糖尿病和使用類固醇等)。在TBNET 研究[3]中,年齡是QFT-GIT 假陰性的唯一顯著變量,但不是T-SPOT.TB假陰性的預測因子,其機制可能是隨著年齡增長,ESAT-6或CFP-10引起的IFN-γ濃度逐漸減少,T-SPOT.TB需要特定數(shù)量的外周血單核細胞,即使較少量的IFN-γ也可檢測到,但QFT-GIT 使用全血而沒有任何單核細胞數(shù)量的標準化,年齡增長引起的IFN-γ濃度減少導致了假陰性結果的出現(xiàn)。Nguyen等[10]的研究則相反,T-SPOT.TB檢測與IGRA 假陰性相關 (校正OR=1.58,95%CI：1.12～2.24)。另外,Wang 等[26]研究則顯示,對于活動性結核病的診斷,IGRA-ELISA 與T-SPOT.TB在敏感度方面并無差異。

5.2 檢測影響因素 IFN-γ的釋放受多種因素的影響。有學者通過酶聯(lián)免疫斑點法檢測到IFN-γ可能存在自發(fā)釋放現(xiàn)象,導致檢測結果不可避免的出現(xiàn)各種偏差[27]。Tebr uegge等[28]對英國倫敦一家大型診斷服務提供商進行的31 932次QFT-GIT 結果進行分析發(fā)現(xiàn),不確定結果的比例在秋季 (8.2%)顯著高于春季 (6.2%,P<0.000 1)、夏季 (4.8%,P<0.000 1)和冬季 (6.2%,P<0.000 1),提示季節(jié)引起的宿主和環(huán)境因素也有可能影響檢測結果。

6 吸煙

Altet等[29]對175例活動性肺結核患者和350例來自接觸者追蹤研究的患者進行研究,Logistic回歸分析顯示吸煙是IGRA 假陰性的主要因素 (校正OR=3.35,95%CI：1.47～7.61,P<0.05),非吸煙者的IFN-γ應答明顯高于吸煙者,吸煙可直接引起IFN-γ 反應減弱,且吸煙量和IFN-γ反應呈劑量依賴性。但TBNET 研究[3]中,吸煙不是假陰性IGRA 試驗結果的危險因素。吸煙與IGRA 的關系有待更多的研究證實。

IGRA 存在著不可避免的假陰性結果,因為其臨界值是在與健康對照的研究中人為劃定的最佳臨界值,而診斷活動性結核的定量界值則是在與未合并活動性結核的患者的對照研究中根據(jù)最大約登指數(shù)計算出來的,倘若為減少假陰性而升高敏感度,則不可避免地造成特異度下降[30]。IGRA 通過檢測IFN-γ水平判斷結核感染,但人體免疫系統(tǒng)極其復雜,任何影響免疫功能的因素都可能或多或少的影響到IFN-γ的釋放,由此推測IGRA 的影響因素眾多,每個因素的影響程度大小各異,這就造成了在不同的研究中,研究對象很難同質化,研究結果也不盡相同甚至相反。另外,IGRA 的操作過程復雜,對操作者的要求較高,檢測過程中任何不規(guī)范行為以及標本采集過程中存在任何差錯,均可能導致結果不準確。

綜上所述,年齡增長、HIV 感染、抗結核治療等可導致IGRA 假陰性。另外,患者的營養(yǎng)狀態(tài) (體質量指數(shù))、等位基因及種族等亦可能導致IGRA 假陰性,合并糖尿病及惡性腫瘤、淋巴細胞下降、結核的病程、痰菌陰性、合并肺外結核、肺部病灶范圍較廣、吸煙、檢測方法及環(huán)境、影響免疫功能藥物的使用等均可能造成IGRA 假陰性,但爭議頗多,有待更多的研究進一步證實。在實際臨床工作中,遇到IGRA 陰性結果不可輕易排除結核感染,需要考慮到年齡、合并癥、抗結核治療、營養(yǎng)狀態(tài)以及免疫功能等各種可能導致假陰性的影響因素,結合患者的臨床表現(xiàn)綜合分析。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突