支氣管肺泡灌洗液中生物標(biāo)志物在特發(fā)性肺纖維化中的研究進(jìn)展

劉睿超 李樂 王若利 孫金英 王瀟 岳紅梅

1蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院730000;2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科730000

特發(fā)性肺纖維化 (idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種病因不明的慢性致死性肺部疾?。?］。在肺纖維化過程中,正常健康肺組織被明顯破壞的肺泡結(jié)構(gòu)和改變的細(xì)胞外基質(zhì)所取代。這些變化導(dǎo)致肺氣體交換中斷,順應(yīng)性降低,最終導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡［2］。IPF 的5 年生存率在20%～40%之間,死亡率高于結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤和膀胱癌等多種惡性腫瘤［3］。目前,IPF 主要的診斷依據(jù)為患者的臨床癥狀、體征、高分辨率CT、肺功能、支氣管肺泡灌洗甚至是肺穿刺活檢。高分辨率CT 在診斷IPF 上有一定的局限性［4］,IPF 臨床表現(xiàn)復(fù)雜,部分患者CT 表現(xiàn)不典型,其他間質(zhì)性肺病也可與IPF表現(xiàn)相同或類似。急性加重是IPF患者快速惡化和高死亡率的常見原因［5］。因此,診斷IPF、監(jiān)測IPF 進(jìn)展、判斷IPF 預(yù)后的生物標(biāo)志物受到了廣泛關(guān)注［6］。IPF 中許多異常表達(dá)的標(biāo)志物無法透過肺內(nèi)皮屏障,檢測其在血漿中的含量比較困難,因此,檢測支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)有一定價值,因支氣管鏡為有創(chuàng)性檢查,實際應(yīng)用仍有一定的局限性。本文簡要綜述BALF中不同生物標(biāo)志物在IPF的診斷、疾病進(jìn)展及判斷預(yù)后中的價值。

1 與診斷有關(guān)的生物標(biāo)志物

1.1 KL-6 KL-6為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表面抗原,是一種由MUC1基因編碼、在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞外表面表達(dá)的糖蛋白,目前被認(rèn)為是一種有應(yīng)用前景的IPF診斷性生物標(biāo)志物,其確切的功能尚不清楚。作為一種趨化因子,它能促進(jìn)成纖維細(xì)胞在肺部的遷移、增殖和存活［7］。KL-6特異性相對較差,不同類型的間質(zhì)性肺病患者的BALF中也可檢測出。Zhu等［8］研究了73例不同類型的彌漫性間質(zhì)性肺病患者,其中IPF患者34例,Ⅰ期結(jié)節(jié)病10例,超敏性肺炎15例,結(jié)締組織疾病14例,并使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測這些患者的血清和BALF中的KL-6水平。結(jié)果顯示,IPF 患者BALF 中KL-6水平為 (437±252)U/ml,高于實驗所測的其他彌漫性間質(zhì)性肺病患者,血清KL-6 水平與BALF 一致,聯(lián)合檢測可提高診斷準(zhǔn)確性。

1.2 表面活性物質(zhì)蛋白 (surfactant protein,SP) 肺表面活性物質(zhì)主要由磷脂和SP 組成,SP 有SP-A、SP-B、SP-C和SP-D 4種,主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌,其中SP-B、SP-C為小分子疏水性表面活性蛋白,主要參與肺泡表面張力的調(diào)節(jié),SP-A、SP-D 為大分子疏水性表面活性蛋白,屬于C型凝集素家族成員,主要參與肺宿主防御功能。Nishikiori等［9］的研究顯示IPF 患者BALF 中SP-D 水平低于結(jié)節(jié)病患者,但血清SP-A 和SP-D 濃度高于結(jié)節(jié)病患者,SP-D 濃度的變化比SP-A 更為明顯,因此IPF 的診斷可能需要多個標(biāo)志物。

1.3 骨膜蛋白 骨膜蛋白是一種細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞蛋白,屬于筋膜蛋白家族,可作為慢性過敏性疾病的介質(zhì),存在于纖維化病變區(qū)域,可于BALF 中測出,目前被認(rèn)為是IPF的一種新型生物標(biāo)志物［10-11］。Ohta等［12］比較了IPF 患者和其他高危疾病 (特應(yīng)性皮炎、系統(tǒng)性硬皮病和哮喘)患者單體骨膜蛋白與總骨膜蛋白的比例,結(jié)果顯示與KL-6和SP-D 相比,單體骨膜蛋白對IPF 的識別能力最強(qiáng)。傳統(tǒng)的試劑盒可檢測骨膜蛋白單體和寡聚體形式 (總骨膜蛋白),目前已開發(fā)了一種新的試劑盒,可用于單獨檢測特異性單體骨膜蛋白。在IPF的檢測中,使用該試劑盒所測出的單體骨膜蛋白水平較總骨膜蛋白高。因此,骨膜蛋白可能成為診斷IPF的生物標(biāo)志物。

1.4 骨橋蛋白 骨橋蛋白 (也稱為分泌性磷蛋白1)是一種高度磷酸化的糖磷酸蛋白,具有酸性特征并富含天冬氨酸［13］,由肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生,在IPF患者的BALF中也顯著升高,作為一種細(xì)胞黏附和遷移分子,骨橋蛋白能顯著增加成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的遷移和增殖,并與多種配體結(jié)合,參與許多病理生理反應(yīng)。Gui等［5］的文章中提到骨橋蛋白可參與細(xì)胞的募集和黏附、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞存活、骨重建和傷口修復(fù)。Pardo等［14］在實驗中測定了18例IPF患者和10名健康對照者BALF中骨橋蛋白的含量,結(jié)果顯示IPF患者BALF中的骨橋蛋白顯著增加。但目前相關(guān)數(shù)據(jù)較少,骨橋蛋白在IPF發(fā)病機(jī)制中的具體作用以及它作為診斷標(biāo)志物的敏感性和特異性尚不明確,對這一蛋白分子進(jìn)行進(jìn)一步的研究有較大的價值［15］。

1.5 S100蛋白 S100蛋白屬于鈣結(jié)合胞漿蛋白家族,通常以同二聚體或異二聚體形式存在。其成員在不同的組織或細(xì)胞類型中特異性表達(dá),細(xì)胞內(nèi)S100蛋白可參與細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、分化、遷移、代謝、細(xì)胞動力學(xué)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞死亡等過程。S100A4、S100A9 屬于此類蛋白,S100A4通過激活成纖維細(xì)胞而促進(jìn)肺纖維化,由于S100A4的細(xì)胞來源不同,其在肺纖維化發(fā)展中的確切作用目前仍不清楚,但有研究發(fā)現(xiàn)在BALF中,S100A4蛋白水平與患者IPF的發(fā)生密切相關(guān)［16］。Hara等［17］研究了28例IPF、15例特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎、20例隱源性組織性肺炎、35例膠原血管疾病相關(guān)性間質(zhì)性肺炎和23 名健康個體 (對照)的血清和BALF 中的S100A9 水平,研究結(jié)果表明與特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎、隱源性組織性肺炎、膠原血管疾病相關(guān)性間質(zhì)性肺炎和健康個體相比,IPF患者的BALF中的S100A9 水平顯著升高,而血清差異不明顯,且BALF中S100A9水平具有足夠的特異性和敏感性,可以區(qū)分IPF和特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎、膠原血管疾病相關(guān)性間質(zhì)性肺炎。鈣粒蛋白也屬于S100蛋白質(zhì)家族。Bargagli等［18］測定了16 例IPF 患 者、17 例結(jié)節(jié)病患者和7名健康者BALF 中鈣粒蛋白B 的濃度,結(jié)果表明IPF組鈣粒蛋白B濃度 ［(31.82±34.80)pg/g］明顯高于結(jié)節(jié)病組 ［(7.05±12.79)pg/g］及對照組 ［(1.84±3.05)pg/g］,IPF 患 者BALF 中S100A4、鈣 粒 蛋 白B(S100A9/MRP14)水平升高,可為IPF的診斷提供依據(jù)。

1.6 黏蛋白 黏蛋白是糖蛋白的一種,是由分泌細(xì)胞分泌的黏多糖組成,有形成凝膠的特殊能力,為凝膠狀分泌物的關(guān)鍵組成部分。其中有2種大分子在氣道和相關(guān)黏液中廣泛表達(dá),分別為MUC5AC 和MUC5B,MUC5AC 主要由近端氣道產(chǎn)生,而MUC5B 主要表達(dá)于遠(yuǎn)端呼吸道［19］。在一項對IPF患者BALF的定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn),氣道上皮細(xì)胞在中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和活化的嗜酸粒細(xì)胞的誘導(dǎo)下,MUC5B和MUC5AC這2種蛋白的表達(dá)量增加了20倍以上［20］,這些證據(jù)表明MUC5B和MUC5AC 在IPF的致病過程中發(fā)揮重要作用。目前沒有相關(guān)數(shù)據(jù)表明MUC5B能否將IPF 與其他間質(zhì)性肺病區(qū)分,但可能有助于IPF的早期診斷。

1.7 CCL 趨化因子是一種可誘導(dǎo)附近具有特定反應(yīng)細(xì)胞定向趨化能力的細(xì)胞因子或信號蛋白,趨化性細(xì)胞因子根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同,可分為CXC、CC、C和CX3C 4個亞族。其中,CCL18在人肺和血清中組成性表達(dá),變態(tài)反應(yīng)、纖維化和癌癥等病變可使其水平進(jìn)一步升高,提示CCL18可能參與穩(wěn)態(tài)和炎癥過程。在穩(wěn)態(tài)條件下,CCL18對幼稚T細(xì)胞有一定的趨化活性,CCL18通過直接激活誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)表型和功能,在肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用［21］?，F(xiàn)已有研究表明IPF 患者血清和BALF 中CCL18水平均高于特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎、呼吸道毛細(xì)支氣管炎間質(zhì)性肺病/脫屑性間質(zhì)性肺炎、隱源性組織性肺炎患者［22］。作為一種生物標(biāo)志物,盡管CCL18 在肺間質(zhì)纖維化中顯示出一定的診斷價值,但目前尚未應(yīng)用于臨床診斷。

1.8 L1 細(xì)胞黏附分子 (L1-cell adhesion molecule,L1-CAM) L1-CAM 為一種細(xì)胞黏附分子,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互接觸,參與細(xì)胞的識別、活化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo),sL1-CAM 為L1-CAM 的 可 溶 性 形 式。Zhang 等［23］研究了16 例IPF、12 例肺癌、12 例慢性咳嗽患者,測定BALF和血清中s L1-CAM 水平。結(jié)果顯示:IPF、肺癌和慢性咳嗽患者BALF 中sL1-CAM 水平分別為 (10.87±0.88)、 (6.34±0.67)和 (5.43±0.65)μg/L。IPF 組BALF中s L1-CAM 濃度明顯高于肺癌組和慢性咳嗽組,患者血清中s L1-CAM 濃度也明顯升高,提示L1-CAM 可能參與IPF的發(fā)病機(jī)制,并有可能作為IPF的診斷性標(biāo)志物。

1.9 基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase,MMP) MMP是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種內(nèi)肽酶,此類酶在正常組織中表達(dá)水平較低,IPF 患者肺組織中表達(dá)增強(qiáng),BALF 中可檢測到多種亞型明顯升高。其中MMP-7能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分 (包括信號分子和受體),可將其定位為纖維化的關(guān)鍵因素［24］。部分亞型可在肺癌［25］等疾病中檢測到,目前無證據(jù)表明MMP可區(qū)分IPF和其他間質(zhì)性肺病。

1.10 其他 關(guān)于IPF的臨床研究［26］發(fā)現(xiàn),仍然有一部分指標(biāo)在BALF 中呈現(xiàn)出較高水平,如CXCL7、CXCL16、CCL24、FAM3B、CRAC1、ICI、ALP 等。目前應(yīng)用最廣泛的生物標(biāo)志物是KL-6、SP-A 和SP-D,這3種生物標(biāo)志物目前在日本已廣泛應(yīng)用于臨床［27］。MMP 也為近年來研究的熱點,其在肺間質(zhì)纖維化診斷方面的價值得到了大部分學(xué)者的認(rèn)可,但BALF 中關(guān)于這些指標(biāo)的研究仍較少,因此在診斷中仍存在一定的不確定性。

2 與疾病進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物

2.1 熱休克蛋白 (heat shock protein,HSP)及其抗體

HSP是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種分子伴侶,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中前膠原蛋白的正確折疊起至關(guān)重要的作用［28］。HSP47屬于Serpin蛋白家族,由Serpin H1基因編碼［29］。研究表明IPF 患者HSP47表達(dá)增加,而且發(fā)現(xiàn)肺中HSP47 表達(dá)水平較高的IPF患者的預(yù)后較HSP47 表達(dá)水平較低的患者差［30］。Mills等［31］檢測了107例IPF患者和66例其他間質(zhì)性肺病患者血清和BALF中HSP72及其抗體水平,結(jié)果顯示所有的樣本均可檢測到不同水平的HSP72,血清中抗Hsp72 IgG 和IgGAM 的濃度在IPF患者進(jìn)展期與非進(jìn)展期中差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但BALF 中抗Hsp72抗體IgGAM 的濃度與IPF患者肺活量和DLCO 占預(yù)計值百分比呈正相關(guān),高濃度的IgGAM 與患者生存率的提高相關(guān)。

2.2 MMP 在一項對肺間質(zhì)纖維化模型小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),大多數(shù)MMP 有促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化發(fā)展的作用,但MMP-13 和 MMP-19 具 有 抗 纖 維 化 作 用,MMP-1 和MMP-10有可能限制損傷后的纖維化作用［32］。在肺間質(zhì)纖維化的過程中,MMP 的調(diào)節(jié)受到影響,從而積極促進(jìn)疾病進(jìn)展［33］。Mc Keown等［34］隨訪了20例IPF患者和8名健康者,發(fā)現(xiàn)早期死亡患者 MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9及蛋白通透性指數(shù)均高于對照組,肺功能迅速下降超過1年的患者M(jìn)MP-8和MMP-9水平較高,而且BALF中MMP-7與DLCO 呈弱相關(guān),MMP-3與FVC 呈弱相關(guān),MMP-7水平升高與死亡率增加具有一定的相關(guān)性。

2.3 內(nèi)皮抑素 內(nèi)皮抑素是一種血管生成抑制劑,為膠原蛋白ⅩⅤⅢ的一個羧基末端蛋白水解酶片段,為內(nèi)皮細(xì)胞基底膜降解的標(biāo)志物［35-36］,還可減少博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化早期BALF 中浸潤的炎性細(xì)胞數(shù)量［37］。Richter等［38］在對IPF患者BALF 中內(nèi)皮抑素的含量的研究中發(fā)現(xiàn),所有IPF患者和正常對照者的BALF中均可檢測到內(nèi)皮抑素,但I(xiàn)PF患者水平較正常者高,BALF 中內(nèi)皮抑素與FVC和DLCO 呈負(fù)相關(guān),表明內(nèi)皮抑素水平與肺功能損害程度相關(guān),并且這項研究使內(nèi)皮抑素抑制劑成為治療肺間質(zhì)纖維化的一種可能手段。

2.4 CCL 一項對39例IPF患者的研究［39］中發(fā)現(xiàn),19例(48%)在確診為IPF后5年內(nèi)死亡,存活患者的DLCO 顯著高于非存活患者,研究人員使用夾心酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定了這些患者BALF中CCL的水平,檢測到CCL3水平在存活和非存活患者之間沒有差異,7例患者BALF 中檢出CCL17,其中6 例5 年內(nèi)死亡。10 例BALF 中檢出CCL22,僅1 例存活,結(jié)果表明了BALF 中CCL17 和CCL22水平升高可能預(yù)示IPF 患者預(yù)后不良。雖然以上指標(biāo)缺乏診斷特異性,但它們可能為與纖維化相關(guān)的間質(zhì)性肺病的可靠預(yù)后標(biāo)志物。

2.5 鈣粒蛋白B Bennett等［40］研究了30 例IPF 患者和30名健康人BALF中鈣粒蛋白B和KL-6的濃度,結(jié)果顯示IPF患者BALF 中鈣粒蛋白B 和KL-6均顯著高于健康對照者,IPF患者中表現(xiàn)為慢性呼吸衰竭 (n=15)的鈣粒蛋白B和KL-6的濃度明顯高于無呼吸衰竭的患者,2種生物標(biāo)志物濃度較高 (＞75%)的患者病情較嚴(yán)重,且第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比、FVC占預(yù)計值百分比、殘氣量占預(yù)計值百分比、肺總量占預(yù)計值百分比、DLCO占預(yù)計值百分比、6分鐘步行距離和BALF 中性粒細(xì)胞百分比較低。BALF中的鈣粒蛋白B和KL-6可作為IPF預(yù)后生物標(biāo)志物,可區(qū)分嚴(yán)重和晚期患者,聯(lián)合檢測這2種生物標(biāo)志物有可能為IPF嚴(yán)重程度分層。

2.6 KL-6 肺間質(zhì)纖維化患者由于基底膜受損,肺泡中KL-6水平升高,進(jìn)而轉(zhuǎn)移至血液中使血液中KL-6水平升高。研究發(fā)現(xiàn)IPF 患者BALF 及血清中KL-6 水平升高明顯,且與FVC和DLCO 呈負(fù)相關(guān),提示BALF中KL-6水平在病情監(jiān)測方面具有顯著作用［41］。

在Murata等［42］的一份病例報告中提到,在IPF 急性加重期,活動性纖維化病灶中有明顯的骨膜蛋白積聚,亞急性纖維化期骨膜蛋白積聚程度明顯強(qiáng)于慢性纖維化期。也有相關(guān)文獻(xiàn)指出端粒長度、MUC5B 基因多態(tài)性可預(yù)測肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展及不良預(yù)后,但其在BALF中的作用目前尚不明確。

隨著醫(yī)療手段的不斷提高,目前關(guān)于肺間質(zhì)纖維化的生物標(biāo)志物越來越多,大多數(shù)實驗只對一種或幾種標(biāo)志物進(jìn)行研究,缺乏系統(tǒng)性、整體性的認(rèn)識,檢測一種指標(biāo)的意義較小,聯(lián)合檢測多種指標(biāo)可提高診斷的準(zhǔn)確性,具有意義的相關(guān)生物標(biāo)志物可納入風(fēng)險評分系統(tǒng),以實現(xiàn)IPF患者的個體化治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突