干細(xì)胞在糖尿病足潰瘍修復(fù)中的研究進(jìn)展

羅彬彬 王 鵬 陳 永 張紅艷

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，江西 南昌 330006 ）

我國的糖尿病發(fā)病率正逐漸增加。據(jù)估計(jì)，2015年全球糖尿病人數(shù)已達(dá)到4.15億;到2019年，全球有4.63億糖尿病患者(20～79歲)。預(yù)計(jì)到2045年，這一數(shù)字將增至6.93億，糖尿病患病率將升至9.9%[1]。糖尿病足潰瘍（DFU）是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，傳統(tǒng)療法包括清除壞死組織、血管重建手術(shù)、控制感染、控制血糖、足部護(hù)理教育、肢體抬高等[2]。然而，這些治療往往不能確保令人滿意的傷口愈合效果，仍有很高的風(fēng)險(xiǎn),致殘率、致死率偏高，且容易復(fù)發(fā)。DFU嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和護(hù)理質(zhì)量。因此，亟需探索新的治療方法促進(jìn)DFU患者創(chuàng)面的愈合，改善患者的預(yù)后。

DFU的發(fā)病與糖尿病所致血管和神經(jīng)病變有關(guān)，但確切的機(jī)制尚未完全闡明。持續(xù)高血糖狀態(tài)可以通過不同的機(jī)制影響傷口愈合，如真皮萎縮、成纖維細(xì)胞數(shù)量減少和增殖能力下降、前膠原合成減少、創(chuàng)面中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水平增加等，使膠原纖維的破壞速度比它們的形成速度更快，從而延緩了足夠肉芽組織的形成。糖尿病也可能通過激活多聚ADP核糖聚合酶(PARP)而損害皮膚結(jié)構(gòu)和破壞皮膚微血管功能，PARP的增加，膠原蛋白合成和分泌的減少、破壞的增加，都可導(dǎo)致DFU的發(fā)生[3]。高血糖狀態(tài)可以通過不同的機(jī)制阻礙傷口愈合，糖尿病神經(jīng)病變導(dǎo)致的感覺缺失可以加重DFU患者足部皮膚的損傷,使DFU遷延難愈；此外，細(xì)胞增殖受損和對生長因子的抵抗都可能會(huì)延遲DFU傷口的愈合。糖尿病患者中巨噬細(xì)胞遷移受損和信號分子釋放不足也抑制了新血管的形成。近年來，國內(nèi)外對各種干細(xì)胞移植治療下肢缺血性相關(guān)疾病進(jìn)行了大量的研究，并取得了顯著的療效。本文主要從干細(xì)胞移植治療DFU的理論機(jī)制，以及不同類型的干細(xì)胞移植治療DFU的研究進(jìn)展作一綜述，為糖尿病足的治療提供參考。

1 干細(xì)胞用于治療DFU的理論依據(jù)

傷口愈合是一系列復(fù)雜的生理反應(yīng)，大致分為3個(gè)階段：急性炎癥期，細(xì)胞增殖期，創(chuàng)面重塑期。機(jī)體受傷后，進(jìn)入急性炎癥期，首先是血小板聚集，凝血級聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)止血，其次趨化因子血小板源性生長因子(PDGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)釋放并吸引巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞到傷口周圍，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞清除傷口的碎片和病原體。在細(xì)胞增殖期，細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素1 (IL - 1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放，促進(jìn)傷口周圍的細(xì)胞增殖[4-5]。在創(chuàng)面重塑期，纖維連接素和透明質(zhì)酸(HA)組成的臨時(shí)基質(zhì)在毛囊細(xì)胞和鄰近表皮干細(xì)胞的幫助下發(fā)生上皮化，成纖維細(xì)胞將以纖維連接素為基礎(chǔ)的微纖維轉(zhuǎn)化為富含膠原蛋白的纖維，成纖維細(xì)胞還負(fù)責(zé)產(chǎn)生纖維連接蛋白和蛋白多糖，這些物質(zhì)形成細(xì)胞外基質(zhì)，在細(xì)胞外基質(zhì)上發(fā)生再上皮化和愈合[6]。而發(fā)生DFU 后，DFU誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞在生長因子的作用下增殖能力下降，巨噬細(xì)胞功能下降，膠原積累減少，角質(zhì)形成細(xì)胞和纖維母細(xì)胞遷移和增殖能力低下，表皮干細(xì)胞能力受損，血管生成減少。血管生成重建了受傷組織的灌注，并為組織提供關(guān)鍵的營養(yǎng)，是傷口愈合的重要機(jī)制之一。此外，糖尿病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞向損傷部位的遷移潛能減弱，進(jìn)一步抑制了血管生成潛能。內(nèi)皮細(xì)胞是血管形成和VEGF表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵。這些因素最終都會(huì)影響DFU的傷口愈合[7]。

目前，DFU的常規(guī)治療包括藥物治療、物理治療和外科治療，多存在患者住院時(shí)間長、費(fèi)用昂貴、傷口很難完全恢復(fù)的問題。干細(xì)胞是一種未分化細(xì)胞，具有自我更新的能力。干細(xì)胞被移植到傷口后，能夠促進(jìn)細(xì)胞因子和生長因子的分泌；以直接和旁分泌的方式促進(jìn)細(xì)胞聚集、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和血管生成；并且在一定的條件下，可以分化成功能細(xì)胞，并生成多種組織器官[8]。因此，干細(xì)胞移植成為治療DFU的新希望。干細(xì)胞可以通過合成和分泌細(xì)胞因子以及分化成各種類型的細(xì)胞如肌成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等參與創(chuàng)面的愈合[9-11]。因此，我們可以利用干細(xì)胞具有分化潛能這一特點(diǎn)，通過干細(xì)胞移植促進(jìn)DFU患者血管內(nèi)皮細(xì)胞因子的表達(dá)和新生毛細(xì)血管的形成，以達(dá)到改善患肢血供、治療DFU的目的[12-13]。

2 干細(xì)胞的來源和分類

目前，用于移植治療DFU的干細(xì)胞主要分為同種異體干細(xì)胞和自體干細(xì)胞。

2.1 同種異體干細(xì)胞 同種異體干細(xì)胞包括臍帶血干細(xì)胞（UCB-MSCs）、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、人脫落的乳牙干細(xì) 胞（stem cells from human exfoliated deciduous teech,SHED）以及胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞（PDMSCs），它們是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）獲得的主要來源。MSCs具有較強(qiáng)的再生和分化能力。目前，有關(guān)MSCs治療DFU的研究最為廣泛。

2.1.1 UCB-MSCs UCB-MSCs與人的其他干細(xì)胞具有相似的形態(tài)學(xué)和相似的細(xì)胞表面抗原，具有分化成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)的潛能[14]。此外，UCB-MSCs具有細(xì)胞倍增時(shí)間短、存活時(shí)間長、抗炎活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，UCB-MSCs被認(rèn)為是一種非常方便和具有多種用途的干細(xì)胞。動(dòng)物研究表明，人UCB-MSCs通過在DFU大鼠腓腸肌和股神經(jīng)中表達(dá)神經(jīng)生長因子(NGF)，能夠預(yù)防或治療DFU[15]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，將異種UCB-MSCs注入DFU患者創(chuàng)面，可在體內(nèi)產(chǎn)生VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），使糖尿病創(chuàng)面更具有愈合的能力[16]。在移植UCB-MSCs后，DFU患者整體愈合率為87.5%，高于傳統(tǒng)方法治療DFU的愈合率，也高于其他治療模式的愈合率[17]，提示UCB-MSCs可能有助于改善此類慢性傷口的愈合。與其他來源的干細(xì)胞相比，從人臍帶血中分離出的MSCs很容易獲得和精制，但由于目前臍帶血的保存成本很高，以及涉及隱私和倫理方面的問題，UCB-MSCs在DFU中的應(yīng)用較少[18]。

2.1.2 ESCs 胚胎干細(xì)胞是一種具有多分化潛能、自我更新強(qiáng)的細(xì)胞，來自于體外受精胚胎的內(nèi)部細(xì)胞群。胚胎干細(xì)胞可以作為未分化細(xì)胞系保存在細(xì)胞培養(yǎng)基中,并可以被誘導(dǎo)分化成任何細(xì)胞系。從胚胎干細(xì)胞中提取的內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞可以分泌生長因子，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。在大鼠糖尿病模型實(shí)驗(yàn)研究中，Lee等[19]通過在創(chuàng)面局部應(yīng)用未分化ESCs，證實(shí)了其可加速糖尿病大鼠的創(chuàng)面愈合。此外，與未予治療的傷口相比，使用ESCs治療的傷口表皮生長因子（EGF）、VEGF和纖維連接蛋白水平顯著增加，促進(jìn)了傷口愈合。但目前ESCs應(yīng)用于DFU臨床治療的報(bào)道較少，部分報(bào)道提示其存在安全性等方面的風(fēng)險(xiǎn)。因此，還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究以確定其安全性與可行性。

2.1.3 SHED 大多數(shù)MSCs，來源于骨髓或臍帶，這對于供體來說是個(gè)侵入性的過程，對供體有傷害，并且臍帶來源非常有限。近年來，來自SHED的干細(xì)胞作為一種新型干細(xì)胞來源引起了廣泛的關(guān)注，它可以減輕對供體的侵襲性和骨髓抽吸時(shí)的創(chuàng)傷，并解決了供體來源有限的問題。SHED具有多向分化、自我更新和高度增殖的能力，還具有較強(qiáng)的神經(jīng)修復(fù)和血管再生的能力，是一種組織再生醫(yī)學(xué)中前景較好的干細(xì)胞[20-21]。經(jīng)SHED處理的施萬細(xì)胞含有多種細(xì)胞因子和趨化因子，可以通過復(fù)雜的過程促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生，施萬細(xì)胞自身的增殖、遷移能力增強(qiáng)，并且部分神經(jīng)元、細(xì)胞外基質(zhì)和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)，可觀察到細(xì)胞活力明顯增加，其分泌的多種營養(yǎng)因子可通過多種機(jī)制促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生[22]。SHED為周圍神經(jīng)再生創(chuàng)造了更理想的細(xì)胞外微環(huán)鏡，因此，SHED可能為創(chuàng)面修復(fù)提供新的治療方法。SHED還可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，分泌多種生長因子，加速新生毛細(xì)血管生成[23]。但目前，有關(guān)SHED用于人體DFU治療的臨床研究尚未見報(bào)道。

2.1.4 PDMSCs 骨髓是MSCs的主要細(xì)胞來源，而人類胎盤是更好的選擇。首先，PDMSCs容易獲得，不會(huì)引起倫理沖突；其次，也是最重要的一點(diǎn)，與骨髓相比，人類胎盤中可以分離出更多的干細(xì)胞；第三，人類胎盤具有較低的免疫原性。PDMSCs具有多向分化能力以及分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合的能力。將PDMSCs加海藻酸鈉粉制成PDMSCs水凝膠，可以維持PDMSCs的活性和細(xì)胞相容性；將其覆蓋于DFU患者創(chuàng)面，可以明顯促進(jìn)糖尿病患者創(chuàng)面愈合并改善創(chuàng)面狀況[24]。PDMSCs促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的可能機(jī)制：一方面，PDMSCs通過誘導(dǎo)潰瘍組織中的新生血管生成以及增加膠原蛋白生成，促進(jìn)傷口愈合；另一方面，PDMSCs還可以分泌大量的血管生長因子，包括VEGF、干細(xì)胞生長因子（HGF）、bFGF、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）等，促進(jìn)潰瘍的修復(fù)[25-26]。此外，糖尿病動(dòng)物模型創(chuàng)面研究結(jié)果也表明，PDMSCs能顯著改善缺血肢體的血流量、毛細(xì)血管密度和肢體功能，減少氧化應(yīng)激和內(nèi)皮損傷[27]。

2.2 自體干細(xì)胞 目前，干細(xì)胞移植的來源，主要以骨髓、外周血、臍帶血為多。其中，又以自體干細(xì)胞移植為多。自體干細(xì)胞包括自體BMSCs、自體外周血干細(xì)胞和自體脂肪組織來源干細(xì)胞（ADSCs）。自體干細(xì)胞移植主要以自體BMSCs和自體外周血干細(xì)胞為多。

2.2.1 自體BMSCs 骨髓是獲得MSCs最常見的組織之一，BMSCs不受免疫限制，不易被細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞識別消滅，并且可以減少細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的形成，介導(dǎo)創(chuàng)面局部免疫功能，通過免疫調(diào)節(jié)、分泌多種生長因子刺激細(xì)胞增殖和分化，改善DFU的微循環(huán)，促進(jìn)DFU修復(fù)。因此，BMSCs移植是DFU的一種安全方法，具有較好的療效。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明， BMSCs無論是經(jīng)創(chuàng)緣皮下移植還是經(jīng)小腿肌內(nèi)移植，都能夠向皮膚受傷部位周邊遷移，通過旁分泌生長因子，促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，通過增加血管生成因子IGF-1、EGF和白細(xì)胞介素-8，刺激血管生成和增加周圍組織再生，促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低炎癥反應(yīng)，加速創(chuàng)面愈合；并可通過表達(dá)角化細(xì)胞特異性蛋白和細(xì)胞角蛋白，增強(qiáng)創(chuàng)面的再上皮化，促進(jìn)大鼠糖尿病潰瘍的愈合[28]。尤其是經(jīng)小腿肌內(nèi)移植后，在創(chuàng)面愈合的后期，VEGF的表達(dá)水平顯著高于其他大鼠。臨床研究也表明，BMSCs移植可促進(jìn)患者血流重建和創(chuàng)面愈合，表明BMSCs可能是治療DFU的可靠治療方案[29]。

2.2.2 自體外周血干細(xì)胞 自體外周血干細(xì)胞移植已被提供給世界各地越來越多的患者，其操作并不復(fù)雜，易為患者所接受。在正常生理情況下，人體外周血干細(xì)胞含量很少，一般通過人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)來動(dòng)員來自骨髓的外周血干細(xì)胞，促進(jìn)其釋放到外周血。這是干細(xì)胞移植治療中動(dòng)員干細(xì)胞的主要方法，也可用于外周血干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病。一般G-CSF給藥后4～5 d，外周血CD34+細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到動(dòng)員前的40～80倍；然而，如果G-CSF停藥1周，外周血CD34+細(xì)胞數(shù)量會(huì)逐漸恢復(fù)到基線水平[30]。此外，G-CSF可調(diào)動(dòng)骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)進(jìn)入外周血中，促進(jìn)缺血區(qū)血管生成。近年來，隨著血細(xì)胞分離技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血液中后對其進(jìn)一步分離純化成為可能。經(jīng)過骨髓干細(xì)胞的釋放、外周血細(xì)胞的分離和濃縮，可用于治療的干細(xì)胞的濃度和數(shù)量顯著增加。Xu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足壞疽患者應(yīng)用自體外周血干細(xì)胞后，其疼痛、患肢冷感、間歇性跛行、潰瘍等癥狀明顯改善；移植后1個(gè)月，激光多普勒掃描檢測外周血流量幅值和血流灌注量較移植前明顯改善；下動(dòng)脈數(shù)字減影血管造影（DSA）成像顯示新的側(cè)支血管形成明顯增加。這表明，應(yīng)用自體外周血干細(xì)胞能極大地改善DFU的血運(yùn)情況,增加患肢血流量，緩解患肢疼痛，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，是一種潛在的有效治療方式。

2.2.3 自體ADSCs 脂肪組織傳統(tǒng)上被認(rèn)為是一種儲(chǔ)能組織，由脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及其他細(xì)胞組成。ADSCs可從人體脂肪組織中大量分離，與BMSCs相比，ADSCs具有在人體組織中含量豐富、不斷更新，且易于分離、擴(kuò)增快、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。從患者自身皮下脂肪組織中分離出來的ADSCs稱為自體ADSCs。ADSCs也可以從同種的另一個(gè)個(gè)體或異種的脂肪組織中獲得。研究表明，ADSCs具有增加肉芽組織形成和增強(qiáng)組織上皮化的能力，并釋放體內(nèi)生長因子， TGF -β1、TGF-β3 、VEGF、HGF、bFGF-2等，促進(jìn)新生血管的形成[31-32]；還可通過增加創(chuàng)面膠原蛋白的分泌和沉積，參與受損組織再生；并刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎的作用，促進(jìn)DFU創(chuàng)面潰瘍的修復(fù)[33]。因此，未來ADSCs移植可能是改善糖尿病患者足部潰瘍的一種新策略。

3 總 結(jié)

干細(xì)胞來源豐富，增殖能力強(qiáng)，易于分離。移植的干細(xì)胞在一定條件下分泌大量細(xì)胞因子和生長因子，并可以分化成內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)毛細(xì)血管形成，增加外周血供，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。MSCs對糖尿病足的改善涉及多種作用機(jī)制，如BMSCs通過促進(jìn)胰島β細(xì)胞功能改善胰島素抵抗，并通過部分重建胰島功能，有效改善2型糖尿病患者高血糖狀況；在糖尿病早期輸注MSCs不僅可促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素降血糖功能，還可以減弱機(jī)體胰島素抵抗，而晚期輸注MSCs僅能減弱機(jī)體胰島素抵抗[34]。自體干細(xì)胞由于具有免疫原性低、倫理問題較少、細(xì)胞來源豐富、易于分離提取等優(yōu)勢，成為一種很有前途的DFU治療方法，但其具體機(jī)制尚不明確，其遠(yuǎn)期療效還需長時(shí)間的觀察研究。因此，未來需要進(jìn)一步探討如何優(yōu)化干細(xì)胞治療的程序，如確定最佳劑量、移植頻率、移植途徑以及干細(xì)胞的原始亞群。此外，干細(xì)胞移植治療DFU的安全性和有效性還需要更大的樣本量和更全面的臨床試驗(yàn)來確定。