結(jié)核分枝桿菌抑制吞噬體-溶酶體形成機(jī)制研究進(jìn)展

秦菱涔 杜先智

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科400010

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌傳播所引起的一種全球流行性疾病,是造成人類死亡的十大原因之一。該疾病每年造成140萬人死亡,盡管目前有多種抗結(jié)核藥物用于抗結(jié)核治療,結(jié)核病依然對全球公共衛(wèi)生造成極大威脅。結(jié)核病是一種以空氣傳播為主要傳播途徑的肺部疾病,亦有少數(shù)可傳播到人體其他器官引起肺外結(jié)核。研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核菌通過阻斷巨噬細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞壞死、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及避免凋亡等途徑來避免機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并誘發(fā)機(jī)體感染[1-3]。正常的吞噬過程可以概括為細(xì)胞外受體與病原體發(fā)生初始相互作用后,信號通路誘導(dǎo)肌動蛋白絲聚合,使細(xì)胞膜伸長形成偽足包圍病原體。細(xì)菌等病原微生物一旦被巨噬細(xì)胞所吞噬,細(xì)胞膜就會閉合成為一種叫做初期吞噬體的結(jié)構(gòu),隨后該結(jié)構(gòu)與溶酶體融合成為晚期核內(nèi)體或吞噬溶酶體。同時該結(jié)構(gòu)中的數(shù)種溶酶體裂解酶在酸性環(huán)境下(最適pH值為4.5～5.0)降解病原體。結(jié)核分枝桿菌能通過以下幾種機(jī)制阻止吞噬體成熟。

1 抑制吞噬體內(nèi)的酸化

結(jié)核分枝桿菌通過胞吞作用或與CR3、FcγR等特異性受體結(jié)合的方式進(jìn)入巨噬細(xì)胞中,并聚集在吞噬體內(nèi)。巨噬細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時,吞噬體未與溶酶體融合,吞噬體內(nèi)呈弱酸性,pH值為6.2左右;當(dāng)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞中將巨噬細(xì)胞激活后,含有結(jié)核分枝桿菌的吞噬體將會與溶酶體融合形成吞噬溶酶體,融合過程中溶酶體中的大量蛋白水解酶將被激活,這些被激活的蛋白水解酶分解細(xì)菌等大分子物質(zhì)形成的終產(chǎn)物使得吞噬體酸化,其pH值甚至可低至4.5[4]。然而事實(shí)上結(jié)核分枝桿菌能在巨噬細(xì)胞中生存、繁殖,且生存的微環(huán)境pH值較高,這表明結(jié)核分枝桿菌可能抑制吞噬體的酸化[5]。

研究表明,巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌將LAM和脂多糖等成分分泌到吞噬體中,同時LAM、脂多糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡內(nèi)作為脂膜循環(huán),吞噬體將會與胞內(nèi)的某些囊泡發(fā)生融合。在融合過程中,吞噬體與來自囊泡的膜蛋白結(jié)合,吞噬體對與之結(jié)合的膜蛋白具有一定選擇性,能選擇性地抑制其與H+-ATP酶結(jié)合,導(dǎo)致吞噬體始終缺乏H+-ATP酶參與酸化作用。這樣就使吞噬體酸化過程障礙,吞噬體始終處于一個較高的pH值,從而阻止了吞噬性溶酶體的形成[6]。同時結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長時會產(chǎn)生并釋放大量的氨,升高溶酶體內(nèi)pH值同時抑制溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解,干擾溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝減少酸性終產(chǎn)物形成,從而抑制了吞噬體-溶酶體的結(jié)合[7]。

2 結(jié)核分枝桿菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子微環(huán)境影響Rab家族分子表達(dá)

研究結(jié)果顯示,結(jié)核分枝桿菌在真核細(xì)胞內(nèi)通過膜融合調(diào)節(jié)Rab分子功能[8]。Rab家族分子是RAS蛋白超家族的成員,其通常具有GTPase折疊和低相對分子質(zhì)量;它們位于細(xì)胞內(nèi)膜中,與人體膜融合過程和囊泡運(yùn)輸功能相關(guān)[9]。Rab20依賴的膜轉(zhuǎn)運(yùn)通路通過增加膜流入吞噬體的數(shù)量,有助于將結(jié)核分枝桿菌維持在膜結(jié)合室中,減少具有胞質(zhì)通路的吞噬體數(shù)量,從而清除病原菌[10]。Rab分子是吞噬體成熟的標(biāo)志物,Rab5出現(xiàn)在吞噬體的早期,Rab9出現(xiàn)在吞噬體的晚期[11]。在正常條件下,Rab7的活性形式(aRab7)與位于吞噬體膜中的Rab7相互作用溶酶體蛋白結(jié)合。aRab7/Rab7相互作用溶酶體蛋白復(fù)合物促進(jìn)與微管相關(guān)的吞噬體/動力蛋白-動力蛋白激活蛋白復(fù)合物之間的聯(lián)系。因此,吞噬體沿向心方向移動,促進(jìn)吞噬體小管延伸到晚期內(nèi)吞區(qū)室并誘導(dǎo)吞噬體成熟過程[12]。活分枝桿菌釋放出一種催化Rab7 GTP/GDP轉(zhuǎn)換的因子,削弱Rab7與Rab7相互作用溶酶體蛋白相互作用的能力,從而阻礙感染的吞噬體與溶酶體融合[13]。同時研究表明Rab22a是晚期內(nèi)體的主要調(diào)節(jié)因子,感染結(jié)核分枝桿菌的吞噬體積累Rab22a以阻止Rab7聚集,使吞噬體成熟延遲。

3 含色氨酸天冬氨酸的外殼蛋白 (tryptophan-aspartate containing coat protein,TACO)/coronin 1的潴留

保持細(xì)胞外信號與細(xì)胞質(zhì)整合的一個重要分子是TACO,也稱為p57、coronin 1或CORO1A[14-15]。TACO對于調(diào)節(jié)多種F-肌動蛋白依賴性細(xì)胞過程至關(guān)重要[16-17]。90%左右含有活細(xì)菌的吞噬體保留了TACO,但與死菌結(jié)合的巨噬細(xì)胞在吞噬作用后的前2小時內(nèi)釋放出TACO。因此,TACO在吞噬體膜上的長時間潴留可能是活細(xì)菌阻礙吞噬體成熟的原因。

在牛分枝桿菌卡介苗感染模型中發(fā)現(xiàn),TACO潴留是對細(xì)菌吞噬產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號的反應(yīng),但是只有當(dāng)細(xì)菌以團(tuán)塊形式吞噬而不是作為單一生物體時才能觀察到TACO潴留。此外,TACO定位于吞噬體膜中的Toll樣受體2型(Toll-like receptor-2,TLR-2),表明TACO潴留是細(xì)菌聚集體阻斷TLR2依賴性抗微生物機(jī)制的結(jié)果[18]。

另一方面,TACO參與抑制吞噬體成熟并非直接作用:因TACO促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+流入增加,激活鈣調(diào)磷酸酶(鈣依賴的磷酸酶),后者直接阻止吞噬體-溶酶體融合[19]。

4 ESX-1系統(tǒng)的蛋白質(zhì)阻斷吞噬體-溶酶體融合

分枝桿菌屬Ⅶ型分泌系統(tǒng)即ESAT-6分泌系統(tǒng)-1(ESX-1),由RD-1及周圍區(qū)域基因編碼,該系統(tǒng)釋放的抗原有以下4種:具有高度免疫原性的CFP-10、ESAT-6以及MM1553和Mh3881c 2種新蛋白。研究證明,以上抗原在抑制吞噬體成熟的過程中是不可或缺的。其中CFP-10、ESAT-6和Mh3881c以抗原依賴的方式分泌,特別是Mh3881c抗原,在其羧基末端斷裂后,會導(dǎo)致吞噬體成熟停滯。而缺乏該系統(tǒng)的分枝桿菌在感染24、72 h后抑制吞噬體-溶酶體融合的效率較低,在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的效率也較低。

ESX-1的吞噬體干擾作用為結(jié)核分枝桿菌的胞外DNA等物質(zhì)提供了細(xì)胞質(zhì)通路,細(xì)胞外DNA作為一種特異性激活配體,直接識別結(jié)核分枝桿菌DNA并激活STING的胞質(zhì)DNA傳感器環(huán)狀GMP-AMP合成酶[20],作用于STING-TBK1-IRF3信號軸,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生[21]。有趣的是,缺乏IRF3的小鼠對長期結(jié)核分枝桿菌感染具有耐藥性[22]。實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),吞噬體破壞將導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌DNA的胞質(zhì)定位觸發(fā)了負(fù)責(zé)發(fā)病機(jī)制的STING-TBK1-IRF3-Ⅰ型干擾素通路[23]。綜上,ESX-1系統(tǒng)能通過胞質(zhì)結(jié)核分枝桿菌DNA誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生破壞吞噬體而阻斷吞噬體-溶酶體融合。

5 自噬參與延遲吞噬體成熟

自噬是細(xì)胞器和細(xì)胞溶質(zhì)分子在自噬體囊泡內(nèi)被識別和降解的過程。自噬和吞噬作用具有共同的特征,研究表明自噬可能調(diào)節(jié)吞噬作用[24]。在自噬中,吞噬細(xì)胞的雙膜結(jié)構(gòu)將細(xì)胞質(zhì)中大分子成分包圍,演變成一個自噬體,與溶酶體融合形成自噬溶酶體[12]。這個過程涉及與自噬有關(guān)的家族蛋白 (Atg)[25],它以復(fù)雜的交互級聯(lián)和多種功能運(yùn)作。自噬包括參與囊泡形成的4種蛋白質(zhì):Atg13、FIP2000、Atg101和Atg1/ULK1復(fù)合物 (ULK1/2)。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白非依賴性途徑和活化蛋白激酶靶點(diǎn)等途徑調(diào)控自噬的起始。Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶Vps34、p150、Atg14和Beclin 1等組成的空泡蛋白分選復(fù)合體影響吞噬體的形成。吞噬體膜的延長首先需要Atg12與Atg5結(jié)合,并與Atg16L形成復(fù)合物[26]。然后與微管相連接的LC3分裂,產(chǎn)生胞質(zhì)LC3-i(Atg8),通過與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-ii,導(dǎo)致LC3-ii附著在隔離膜上[27]。關(guān)閉隔離膜使得自噬體形成過程得以完成,隔離膜與溶酶體融合形成自溶酶體并加工和消化細(xì)胞內(nèi)病原體。

結(jié)核分枝桿菌可能通過阻止自噬體發(fā)展為自噬溶酶體或抑制其在自噬體內(nèi)的降解等機(jī)制逃避自噬過程。磷脂酰肌醇3-激酶依賴性結(jié)合PI3P,PI3P參與自噬體成熟。因此,結(jié)核分枝桿菌的糖基化磷脂酰肌醇充當(dāng)了細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸途徑的抑制劑,這對結(jié)核分枝桿菌抑制自噬體成熟是不可或缺的。

另一方面,LC3相關(guān)吞噬作用 (LC3-associated phagocytosis,LAP)在對抗多種細(xì)胞內(nèi)病原體的感染中發(fā)揮重要作用。LAP包括傳統(tǒng)受體和自噬受體,但作為自噬作用的觸發(fā)因子的確切機(jī)制目前仍不清楚。TLR和c型凝集素等模式識別受體在啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用,該信號傳導(dǎo)導(dǎo)致吞噬體內(nèi)LC3結(jié)合,誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的合成。研究表明,結(jié)核分枝桿菌可以防止LAPosome融合,促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的存活和增殖。

只有部分吞噬體與LC3有關(guān)[28]。研究表明,吞噬溶酶體囊泡中發(fā)現(xiàn)的beclin和LC3等分子在小鼠巨噬細(xì)胞吞噬體中的易位與雙膜囊泡無關(guān)。該機(jī)制由識別受體如Fc、TLR、磷脂酰絲氨酸受體TIM4或β-葡聚糖Dectin-1受體啟動;一旦發(fā)生受體識別,病原體就被吞噬并隔離在一個單膜吞噬體內(nèi),此時,在LAP下,磷脂酰肌醇-3-磷酸生成的Ⅲ類pi3-激酶復(fù)合物特異性結(jié)合到該單膜吞噬體腔室內(nèi),最后LC3-Ⅱ介導(dǎo)吞噬體與溶酶體快速融合[29]。

與傳統(tǒng)的吞噬作用不同,在LC3介導(dǎo)的吞噬作用中,細(xì)胞類型和病原體將影響抗原表達(dá)。例如,在小鼠巨噬細(xì)胞中,抗原處理速度加快,而在人類細(xì)胞中,吞噬體的成熟似乎有所延遲[30]。有些微生物已具有完全避免吞噬體作用的功能,在這些區(qū)室內(nèi)或在宿主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)繁殖。

綜上所述,結(jié)核分枝桿菌是一種細(xì)胞內(nèi)病原體,它具有多種機(jī)制來逃避宿主的免疫反應(yīng)。抑制吞噬體成熟、阻止吞噬體溶酶體形成作為機(jī)制之一將直接影響抗原加工和呈遞,導(dǎo)致其他細(xì)胞群的無效激活,從而使結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存、繁殖。盡管在該領(lǐng)域已有相關(guān)研究,但這種機(jī)制的確切性質(zhì)仍然是難以捉摸的,需要進(jìn)一步研究其阻止吞噬體成熟的分子機(jī)制。同時抑制吞噬體溶酶體形成并非結(jié)核分枝桿菌存活、增殖、致病的唯一機(jī)制,除此之外,還有降低抗原呈遞分子的表達(dá)、通過壞死促進(jìn)細(xì)胞死亡、防止細(xì)胞凋亡等機(jī)制。因此,進(jìn)一步探討吞噬體成熟和吞噬體-溶酶體融合的機(jī)制對于在早期階段更好地控制疾病至關(guān)重要,為開發(fā)新的診斷方法和治療提供了新思路。

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