基于Illumina MiSeq測序技術(shù)不同地區(qū)辣椒醬細(xì)菌多樣性分析

寧明，趙馨馨，董蘊，倪慧，單春會，張振東，郭壯,3*

(1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；3.恩施市公共 檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000)

辣椒醬因微生物的發(fā)酵作用，兼具營養(yǎng)豐富、味美色艷等特點廣受消費者喜愛，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]。徐廷弼等[2]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和16S rDNA測序的方法對存在產(chǎn)氣現(xiàn)象的辣椒醬生產(chǎn)設(shè)備和空氣中的細(xì)菌菌群種類和含量進(jìn)行了解析，結(jié)果顯示：乳桿菌屬和芽孢桿菌屬在辣椒醬中占明顯優(yōu)勢。丁文等[3]分別采用16S rDNA和ITS序列鑒定分離的細(xì)菌和真菌菌株，并運用PCR-DGGE法分析貯藏終點辣椒醬中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)貯藏終點優(yōu)勢細(xì)菌為乳酸菌和蠟樣芽孢桿菌。傳統(tǒng)辣椒醬中具有相對較高的微生物多樣性，不僅蘊含具有潛在益生功能及影響產(chǎn)品品質(zhì)形成的菌株，亦可能存在食源性致病菌[4]。越來越多的研究表明不同地區(qū)同一類發(fā)酵食品中微生物多樣性可能存在一定的差異[5]，而關(guān)于咸豐地區(qū)辣椒醬中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究鮮見報道。

與其他二代高通量測序技術(shù)相比，Illumina MiSeq平臺采用宏基因組學(xué)的研究策略，不僅大大降低了成本，而且增加了每個樣品的測序深度，兼具測序量大和精確度高等特點[6]，目前在發(fā)酵食品和動物腸道微生物多樣性解析領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[7,8]，這為全面反映辣椒醬中細(xì)菌微生物群落特點提供了新的研究方法。目前對于辣椒醬的研究主要集中于品質(zhì)分析或特定性能菌株的篩選等制作環(huán)境相對開放的傳統(tǒng)辣椒醬中[9,10]，而對于辣椒醬中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析鮮有報道。

本研究以采集的辣椒醬為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對其微生物多樣性進(jìn)行深入解析，同時對不同地區(qū)辣椒醬的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。在對辣椒醬中細(xì)菌群落進(jìn)行全面解析的同時，探討挖掘核心細(xì)菌類群，以期為功能性菌種資源的開發(fā)及產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

辣椒醬：從湖北省恩施土家族苗族自治州咸豐縣農(nóng)貿(mào)市場采集10個辣椒醬樣品，分別命名為XFLJ1～XFLJ10，每個樣品200 g左右，制作時間在15～20 d。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒：德國QIAGEN公司；dNTPs Mix、Fast Pfu Buffer、5×Trans StartTM、Fast Pfu Fly DNA Polymerase：寶生物工程(大連)有限公司；338F/806R正向及反向引物：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；VeritiTM96孔梯度PCR擴(kuò)增儀 美國AB公司；FluorChem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司；DYY-12電泳儀 北京市六一儀器廠；Illumina MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；R930機(jī)架式服務(wù)器 美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

稱取10 g辣椒醬樣品加入蒸餾水40 mL后于300 r/min條件下離心10 min取上清液，再以10000 r/min離心10 min后保留沉淀，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取微生物宏基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及MiSeq高通量測序

以純化后的DNA為模板，采用包含“5′-ACTCCTACGGGAG-GCAGCA-3′”序列的正向引物和“5′-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3′”的反向引物擴(kuò)增16S rDNA V4～V5區(qū)進(jìn)行高通量測序分析。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系[11]：擴(kuò)增體系為20 μL，10 ng模板DNA，0.8 μL 5 μmol/L正反向引物，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5×PCR緩沖液4 μL，使用超純水補(bǔ)充剩余體系。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，然后執(zhí)行95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35 個循環(huán)，完成72 ℃ 10 min后于4 ℃保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后的PCR產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

采用QIIME軟件平臺調(diào)用UPARSE進(jìn)行兩步UCLUST法聚類[12]，繼而應(yīng)用Chimera Slayer去除嵌合體序列[13]，從而得到優(yōu)化序列用于操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)分析，整合RDP和Greengenes兩個數(shù)據(jù)庫確定細(xì)菌OTU代表性序列的微生物分類水平并統(tǒng)計每個樣本的群落組成[14,15]，同時一方面對辣椒醬細(xì)菌微生物的超1(Chao1)和香農(nóng)(Shannon)指數(shù)等α多樣性指標(biāo)進(jìn)行計算[16]，另一方面使用基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離[17]的主成分分析法(principal component analysis，PCA)和非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)聚類進(jìn)行β多樣性等一系列群落結(jié)構(gòu)和組間差異的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)下載及上傳

本研究首先從MG-RAST數(shù)據(jù)庫(http://www.mg-rast.org)中下載當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬細(xì)菌相關(guān)序列(ID號為mgp82587)。咸豐地區(qū)10 個辣椒醬樣品MiSeq高通量測序數(shù)據(jù)均已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(mgp89819)。

1.4 多元統(tǒng)計學(xué)分析及圖表繪制

應(yīng)用方差分析(multivariate analysis of variance，MANOVA)手段解析2類地區(qū)辣椒醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并采用Mann-Whiney檢驗對其顯著性進(jìn)行分析；通過LDA算法甄別與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著差異相關(guān)的關(guān)鍵類群并通過各樣品之間的歐式距離矩陣計算組間差異。系統(tǒng)發(fā)育樹由Mega 6.0軟件繪制，其他圖均在Origin 8.6軟件中完成繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品16S rRNA基因序列測序深度及質(zhì)量評估

經(jīng)質(zhì)控合格后，本研究共獲得379918條高質(zhì)量序列，平均每個樣品序列為37992條。序列按照97%相似性進(jìn)行操作分類單元劃分后，共得到25453個OTU。辣椒醬樣品16S rRNA測序結(jié)果及各分類水平數(shù)量見表1。

表1 辣椒醬樣品測序結(jié)果及各分類地位數(shù)量Table 1 Sequencing results and number at different taxonomical levels of chili sauce samples

注：“*”表示細(xì)菌超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均在測序量為22010條序列時計算所得。

由表1可知，在10個辣椒醬樣品中XFLJ9的超1指數(shù)最大，而樣品XFLJ1的香農(nóng)指數(shù)最大，這說明XFLJ9樣品具有最高的細(xì)菌物種多樣性，而XFLJ1樣品細(xì)菌物種豐度最大。在OTU劃分的基礎(chǔ)上，所有序列劃分為133個門、316個綱、488個目、851個科和1342個屬，其中有0.09%和7.18%的序列不能鑒定到門和屬水平。

2.2 基于各分類學(xué)地位辣椒醬中細(xì)菌相對含量的組成分析

為得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，本研究在序列豐富度和多樣性分析的基礎(chǔ)上，采用97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在門水平統(tǒng)計每個樣品的群落組成。根據(jù)各個樣品不同門的細(xì)菌所占比例作圖，將相對豐度低于1.0%的門合并為其他，不同樣品中細(xì)菌在分類門水平上的分布情況見圖1。

圖1 細(xì)菌在門水平的組成及相對含量Fig.1 The composition and relative content of bacteria at the phylum level

由圖1可知，在辣椒醬10個樣品中(XFLJ1～XFLJ10)共鑒定出33個門，平均豐度大于1.0%的有4 個門，分別隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)67.46%、變形桿菌(Proteobacteria)24.71%、放線菌(Actinobacteria)4.75%和擬桿菌(Bacteroidetes)1.83%，其中僅有0.09%的序列不能鑒定到門水平。從門的水平上講，細(xì)菌的種類大致相同，但豐度差別較大。

10個辣椒醬樣品中細(xì)菌在分類屬水平上的分布情況見圖2。

圖2 細(xì)菌在屬水平的組成及相對含量Fig.2 The composition and relative content of bacteria at the genus level

由圖2可知，樣品中相對含量大于1.0%的細(xì)菌屬有8個，分別為隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus，57.66%)、芽孢桿菌(Bacillus，12.25%)、明串珠菌(Leuconostoc，4.29%)、片球菌(Pediococcus，2.29%)和魏斯氏菌(Weissella，1.97%)；隸屬于變形桿菌(Proteobacteria)的假單胞菌(Pseudomonas，1.90%)、鹽單胞菌(Halomonas，1.44%)和隸屬于放線菌(Actinobacteria)的棒狀桿菌(Corynebacterium，1.30%)。

結(jié)果顯示：在屬水平上，不同樣品中所含細(xì)菌種類的多樣性及其豐度存在較大差異。對于樣品XFLJ3而言，乳桿菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)和魏斯氏菌(Weissella)是主要的菌屬，其平均豐度在31.11%左右，未知屬的豐度達(dá)到3.60%，其他種類的屬的含量所占比例都較低。隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus)和魏斯氏菌(Weissella)能夠產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，改善發(fā)酵食品的風(fēng)味缺點，使其兼具益生和味美的雙重功能[18]，其可作為豐富和完善乳酸菌資源庫和基因庫的菌種來源。相對而言，樣品XFLJ10中物種多樣性最為豐富，其中棒狀桿菌(豐度為42.44%)和鹽單胞菌(豐度為22.54%)是主要的微生物，其含量遠(yuǎn)高于辣椒醬中其他樣品；乳酸桿菌(Lactobacillus)和片球菌(Pediococcus)的豐度分別為12.17%和4.87%。此外，在研究中發(fā)現(xiàn)辣椒醬XFLJ1中含有17.60%的芽孢桿菌(Bacillus)，這可能與其具有較高濃度的食鹽耐受性有關(guān)，同時芽孢桿菌亦作為影響濃香型大曲等發(fā)酵食品的關(guān)鍵微生物類群[19]，對其風(fēng)味品質(zhì)的工藝優(yōu)化具有積極的影響。本研究結(jié)果表明，辣椒醬中細(xì)菌的構(gòu)成較為復(fù)雜，菌群的種類和數(shù)量也不盡相同。

2.3 基于多元統(tǒng)計學(xué)分析不同地區(qū)辣椒醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

為確定影響辣椒醬中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的因素，根據(jù)前期對湖北省當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬的研究[20]，本研究進(jìn)一步在分類操作單元非加權(quán)歐式距離的PCA主坐標(biāo)分析及UPGMA的基礎(chǔ)上對16個辣椒醬(10個咸豐地區(qū)辣椒醬和6個當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬)樣品的β多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的比較分析，基于OTU水平非加權(quán)UniFrac距離顯著性檢驗的主坐標(biāo)分析見圖3。

圖3 基于非加權(quán)UniFrac距離的細(xì)菌主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinate analysis of bacteria based on unweighted UniFrac distance

由圖3可知，以權(quán)重最高的PC1(26.45%)和PC2(18.25%)兩個主成分繪制PCA，當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬樣品主要分布在第一象限，而咸豐地區(qū)辣椒醬樣品分布在第二、第三象限。由此可知，雖然辣椒醬樣品中存在大量的核心細(xì)菌菌群，但2類地區(qū)辣椒醬距離相差較遠(yuǎn)，這說明2個樣本間可能存在較大的差異。為了能夠更加清晰地反映樣品菌群結(jié)構(gòu)存在的差異，本研究進(jìn)一步采用UPGMA顯著性檢驗對2類辣椒醬樣品間的差異性進(jìn)行層次聚類分析，基于OTU的16個辣椒醬樣本的聚類分析見圖4。

圖4 基于OTU水平非加權(quán)UniFrac距離的 UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of OTU level based on unweighted UniFrac distance

由圖4可知，用于比較的16個辣椒醬樣品大致可分為3個大類，其中咸豐地區(qū)辣椒醬樣品XFLJ1～XFLJ9和當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬樣品DYLJ1～DYLJ6各為一類，而XFLJ10樣品被聚為一類，這與主成分分析結(jié)果基本一致。整體從16個樣品來看，相似度差別較大，這可能與地域差異性導(dǎo)致的辣椒醬核心類群的不同有關(guān)。結(jié)合圖3可知，造成這種現(xiàn)象的原因可能是辣椒醬樣品XFLJ10相較于其他9個樣品來說，有相對含量遠(yuǎn)高于其他樣品的鹽單胞菌(Halomonas)和棒狀桿菌(Corynebacterium)等優(yōu)勢細(xì)菌屬的存在。

在非加權(quán)UniFrac水平上，分支的長度能夠較好地反映群落的相對豐度差異，由圖4結(jié)果還可知，咸豐地區(qū)辣椒醬樣品各分支長度整體上要大于當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬樣品各分支，為探究其顯著差異性，本研究進(jìn)一步使用歐氏距離對辣椒醬樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組間差異進(jìn)行解析，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，通過采用歐式距離對當(dāng)陽地區(qū)(0.522±0.025)和咸豐地區(qū)(0.659±0.0743)辣椒醬微生物群落結(jié)構(gòu)組間差異進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，由Mann-Whiney檢驗得出2組樣本間差異非常顯著(p<0.01)，說明咸豐地區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組間差異要顯著高于當(dāng)陽地區(qū)。

圖5 基于非加權(quán)歐氏距離的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組間差異分析Fig.5 Differences in the bacterial community structure based on unweighted UniFrac distances

注：“**”表示差異非常顯著，p<0.01。

2.4 基于分類水平的關(guān)鍵細(xì)菌類群的甄別

根據(jù)上述研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，咸豐地區(qū)和當(dāng)陽地區(qū)的辣椒醬微生物群落結(jié)構(gòu)差異極顯著(p<0.01)。本研究以辣椒醬分組(咸豐地區(qū)/當(dāng)陽地區(qū))為起非監(jiān)督作用的解釋變量，以LDA分?jǐn)?shù)(LDA Score)取對數(shù)(log10)之后相對值大于3的分類操作單元為響應(yīng)變量，甄別了影響2類地區(qū)辣椒醬微生物群落結(jié)構(gòu)在豐度上差異顯著的關(guān)鍵細(xì)菌。

圖6 LDA值分布柱狀圖Fig.6 The distribution histogram of LDA values

由圖6可知，2組樣品具有統(tǒng)計學(xué)差異，從宏觀上描述了所有類群和總體之間的離散冗余程度，2類辣椒醬在該空間中具有最佳的可分離性。由此可見，12個主要細(xì)菌類群代表了2類辣椒醬微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌類群。隸屬于Firmicutes(厚壁菌門)的Bacillaceae(芽孢桿菌)科和Bacillus；隸屬于Actinobacteria(放線菌)的Actinomycetales，Brevibacteriaceae，Brevibacterium(短桿菌)和Kocuria；隸屬于Proteobacteria(變形菌門)的Aeromonadaceae，Rhodobacterales，Rhodobacterceae及Massilia(位于圖的左側(cè)，即咸豐地區(qū)辣椒醬)，這說明該10個類群在咸豐地區(qū)辣椒醬中的相對含量可能較高；隸屬于Proteobacteria(變形菌門)的Ramlibacter和Hafniaceae(位于圖的右側(cè)，即當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬)，這說明該2個細(xì)菌類群在當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬中的相對含量可能較高。整體上看，咸豐地區(qū)辣椒醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)種類多樣性及豐度要顯著高于當(dāng)陽地區(qū)，這與圖6的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

MiSeq高通量測序結(jié)果表明，咸豐地區(qū)10個辣椒醬樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌類群主要是由隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)和魏斯氏菌(Weissella)；隸屬于變形桿菌(Proteobacteria)的假單胞菌(Pseudomonas)和鹽單胞菌(Halomonas)及隸屬于放線菌(Actinobacteria)的棒狀桿菌(Corynebacterium)構(gòu)成。通過對比當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬細(xì)菌類群，對辣椒醬樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵細(xì)菌類群進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)咸豐地區(qū)辣椒醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)種類多樣性及豐度要顯著高于當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬。