三草尿毒靈通過調(diào)控Shh/Gli 信號通路表達減輕腎臟纖維化的實驗研究*

周燕妮 蘇雨田 許正錦

（北京中醫(yī)藥大學廈門醫(yī)院 福建廈門 361000）

我國慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease,CKD）的流行病學調(diào)查結果顯示，我國成人CKD 患病率約為10.8%[1]。在全球范圍內(nèi)，CKD 患者進展到終末期腎?。‥nd Stage Renal Disease,ESRD）的數(shù)量每年遞增。而隨著糖尿病和肥胖癥等代謝性疾病發(fā)病率的不斷增長，CKD 的患病率將進一步上升[2]。CKD 已經(jīng)成為“全球公共健康問題”。

腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial Fibrosis,TIF）是腎臟受損時發(fā)生瘢痕化并重塑的病理過程。TIF 的病理特征是間質(zhì)組織炎細胞浸潤、腎小管萎縮、肌成纖維細胞激活及細胞外基質(zhì)成分（Extracellular matrix,ECM）過度堆積，最終由瘢痕組織取代正常的腎臟結構，造成腎功能減退或喪失。大量的臨床和實驗數(shù)據(jù)表明，TIF 是導致腎功能逐漸喪失的主要決定因素，是各種病因引起CKD 的共同發(fā)病途徑[3～5]，其病變程度與病情預后密切相關。

既往研究發(fā)現(xiàn)，Shh/Gli 信號在促進腎臟纖維化過程中發(fā)揮了重要作用，在多種腎纖維化動物模型中表達上調(diào)。如在腎缺血-再灌注（IRI）、單側輸尿管結扎（UUO）等多種腎臟疾病中Shh/Gli 信號都被重新激活[6～7]。此外，在人體腎臟病的標本中，也可以看到Shh 蛋白表達上調(diào)。因此，抑制Shh/Gli 信號的激活是防止腎臟纖維化的重要環(huán)節(jié)。

中醫(yī)藥在防治CKD 進展、延緩腎臟纖維化等方面有其獨特優(yōu)勢[8～9]。三草尿毒靈是全國名老中醫(yī)專家學術經(jīng)驗繼承指導老師趙紀生教授的經(jīng)驗方，具有健脾益腎、泄?jié)崤哦尽⒒钛龅墓π?。前期的臨床研究和動物實驗表明，三草尿毒靈不僅可減輕臨床癥狀，延緩CKD 的進展，還能有效減少血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅳ型膠原和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的水平[10～13]。本研究通過動物實驗，觀察三草尿毒靈對Shh/Gli 信號表達的影響，從信號轉導通路水平進一步揭示其抗腎纖維化的作用機制，為三草尿毒靈的臨床應用提供基礎理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性BALB/c 小鼠（體質(zhì)量20～25 g）24 只，購于北京動物實驗中心，飼養(yǎng)于廈門大學醫(yī)學院動物實驗中心SPF 級動物房，自由飲水。

1.2 藥物 三草尿毒靈方由黃芪、葫蘆巴、魚腥草、鹿銜草、積雪草、大黃、黃連、法半夏、茯苓、枳實、川芎等組成，購于廈門市中醫(yī)院中藥房，煎煮并濃縮成含生藥0.6 g/ml 的湯劑。Shh/Gli 信號小分子抑制劑環(huán)巴胺（Cyclopamine,CPN）購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 分組、手術與用藥 小鼠隨機分為假手術組（簡稱Sham 組）、單側腎缺血再灌注組（Unilateral Renal Ischemia/Reperfusion Injury,UIRI）、單側腎缺血再灌注三草尿毒靈組（簡稱SCNDL 組）和單側腎缺血再灌注CPN 組（簡稱CPN 組），各6 只。小鼠腹腔注射麻醉，暴露腎臟后分離腎蒂。Sham 組只暴露腎蒂但不夾閉腎蒂，用微型動脈夾夾閉左側腎蒂30 min 構建單側腎缺血再灌注模型。UIRI 組術后第3天起每天通過腹腔注射生理鹽水，CPN 組術后第3天起每天通過腹腔注射CPN（按5 mg/kg 注射），SCNDL 組術后第3 天起每天灌胃三草尿毒靈湯劑（按0.15 ml/10 g 灌胃）。術后第10 天，麻醉小鼠后，暴露小鼠右腎，結扎腎蒂后切除右腎。假手術組只做腎包膜剝離，不做腎臟切除。在術后第11 天處死小鼠，收集血液和腎臟組織，用于后續(xù)檢測分析。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 血肌酐及尿素氮水平檢測 收集小鼠血液后，常溫靜置2 h，再2 500 rpm，4℃離心15 min，取上清液，用自動生化儀測量小鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。

1.4.2 腎組織病理學檢查 腎組織塊浸入4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm 厚切片供常規(guī)Masson 染色及免疫組化檢測，操作按說明進行。實驗使用抗Shh 抗體（sc-9024）等抗體。

1.4.3 Western blot 檢測蛋白表達 提取腎組織總蛋白，BCA 法測量蛋白濃度后進行電泳、轉膜、封閉、孵育相應一抗：抗Fibronectin 抗體（F3648）、兔抗CollagenⅢ抗體（ab7778）、鼠抗α-SMA 抗體（A2547）、抗Shh 抗體（sc-9024）、抗Gli 1 抗體（AF3455）、抗α-tubulin 抗體（T9026），以及抗β-actin 抗體（MAB1501）；再孵相應二抗后用ECL化學發(fā)光液顯影曝光，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結果。

1.4.4 qRT-PCR 檢測mRNA 的表達 用TRIzol 提取腎臟組織RNA 后，使用Promega 公司的試劑盒將RNA 反轉錄獲得cDNA，再選擇相應引物（見表1）進行qRT-PCR 反應。結果采用內(nèi)參基因β-actin的表達量作為矯正。

表1 qRT-PCR 所用引物

2 結果

2.1 各組腎功能比較 腎功能檢測結果表明，與Sham 組相比，UIRI 組血肌酐和尿素氮水平明顯升高（P＜0.05）；與UIRI 組比較，SCNDL 組、CPN 組血肌酐和尿素氮水平明顯降低（P＜0.05）；SCNDL 組與CPN 組血肌酐和尿素氮水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組腎功能比較

表2 各組腎功能比較（n＝6，±s）

表2 各組腎功能比較（n＝6，±s）

2.2 各組腎臟間質(zhì)纖維化情況比較 Masson 染色結果表明，UIRI 組、SCNDL 組、CPN 組腎臟間質(zhì)纖維化面積均大于Sham 組（P＜0.05）；SCNDL 組與CPN 組腎臟間質(zhì)纖維化面積均小于UIRI 組（P＜0.05）；SCNDL 組與CPN 組腎臟間質(zhì)纖維化面積比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組腎臟間質(zhì)纖維化情況比較

表3 各組腎臟間質(zhì)纖維化評分比較（n＝6，分，±s）

表3 各組腎臟間質(zhì)纖維化評分比較（n＝6，分，±s）

2.3 各組細胞外基質(zhì)表達情況比較 UIRI 小鼠的腎組織中，無論是mRNA 水平還是蛋白水平，F(xiàn)N、COL-Ⅲ和α-SMA 表達水平均較Sham 組小鼠顯著升高（P＜0.05）；SCNDL 組和CPN 組mRNA、蛋白水平，F(xiàn)N、COL-Ⅲ和α-SMA 表達水平均低于UIRI組（P＜0.05）；SCNDL 組、CPN 組mRNA、蛋白水平，F(xiàn)N、COL-Ⅲ和α-SMA 表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、表4、表5。

圖3 各組細胞外基質(zhì)表達情況比較

表4 各組腎組織細胞外基質(zhì)表達情況比較（n＝6，±s）

表4 各組腎組織細胞外基質(zhì)表達情況比較（n＝6，±s）

表5 各組腎組織纖維化蛋白表達情況比較（n＝6，±s）

表5 各組腎組織纖維化蛋白表達情況比較（n＝6，±s）

2.4 各組Shh/Gli 信號表達情況比較 qRT-PCR 檢測結果顯示，UIRI 組腎組織Gli 1 mRNA 水平較Sham 組明顯升高（P＜0.05）；SCNDL 組和CPN 組Gli 1 mRNA 水平顯著低于UIRI 組（P＜0.05）；同樣，Western blot 檢測顯示SCNDL 組和CPN 組Gli 1蛋白表達低于UIRI 組（P＜0.05）。SCNDL 組和CPN組Gli 1 蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4、表6。

圖4 各組Shh/Gli 信號表達情況比較

表6 各組腎組織Gli 1 基因表達情況比較（n＝6，±s）

表6 各組腎組織Gli 1 基因表達情況比較（n＝6，±s）

3 討論

Hedgehog（Hh）信號是一組進化上保守的發(fā)育相關信號，能夠調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、損傷修復和腫瘤發(fā)生等多種生物學過程[14～15]。哺乳動物Hh 信號的配體有三種，分別為Shh、Ihh（Indian hedgehog）和Dhh（Desert hedgehog），其中Shh 的研究最為廣泛。Shh 在細胞外通過與胞膜受體Patched 1（Ptch 1）相結合，誘導Ptch 1 內(nèi)聚體形成和降解，使其喪失對Smoothened（Smo）蛋白的抑制作用，從而引起Smo 的激活?；罨腟mo 蛋白經(jīng)過多種步驟進一步激活Gli 轉錄因子家族?；罨腉li 轉錄因子進入細胞核內(nèi)，誘導靶基因的轉錄。正常情況下，當腎臟發(fā)育完成后，Shh/Gli 信號變?yōu)殪o息狀態(tài)。但當腎臟發(fā)生病變時，Shh/Gli 信號被重新激活促進腎臟纖維化。在既往的動物實驗研究中，無論是UUO、阿霉素腎?。ˋDR）、5/6 腎切除模型，還是單側腎缺血再灌注模型，激活的Shh/Gli 信號都會促進腎臟纖維化的發(fā)生及發(fā)展，而阻斷Shh/Gli 信號則可抑制腎臟纖維化[16～17]。

成纖維細胞的激活在腎臟纖維化發(fā)生中有關鍵作用。在正常成年人腎臟中，成纖維細胞位于腎實質(zhì)毛細血管叢和小管上皮細胞之間的間質(zhì)區(qū)域內(nèi)，其形態(tài)表現(xiàn)為星狀形，并擁有多個細胞突起，連接于腎小管和毛細血管基底膜之間[18]。靜息狀態(tài)下，間質(zhì)成纖維細胞膜表達CD73 抗原，能夠產(chǎn)生促紅細胞生成素，并且表達血小板來源生長因子受體β（PDGFRβ）和成纖維細胞特異蛋白1（FSP 1）。腎臟損傷時，成纖維細胞受到激活，細胞增殖異?；钴S，同時其表型發(fā)生轉變，表達激活狀態(tài)特異的分子標志物α-SMA，并產(chǎn)生大量ECM 蛋白，成為肌成纖維細胞。那么肌成纖維細胞在腎臟受損后是如何激活的，便是腎臟纖維化研究領域中的一個關鍵課題。腎實質(zhì)的主要組成細胞是腎小管上皮細胞，它們易受多種代謝紊亂、免疫反應、缺血、低氧和腎毒素刺激，是腎臟損傷的主要靶細胞[19]。有學者認為受損腎小管上皮和間充質(zhì)成纖維細胞存在腎小管上皮-間充質(zhì)細胞對話（EMC），從而引起成纖維細胞的表型改變。并且Shh 可能是介導EMC 的一個重要介質(zhì)。在腎臟纖維化發(fā)生過程中Shh 在腎小管上皮細胞的表達明顯增高，而它的靶細胞為成纖維細胞，能夠誘導成纖維細胞活化。這些結果提示，腎小管來源的Shh 通過EMC 對成纖維細胞激活和增生可能起到了至關重要的作用。

三草尿毒靈全方通補兼施，方中既有黃芪、葫蘆巴健脾溫腎以扶正，又有魚腥草、鹿銜草、積雪草、大黃清熱解毒、通腑泄?jié)嵋造钚?；配以黃連、法半夏、茯苓、枳實顧護脾胃，使中焦樞紐運轉正常，以防閉門留寇；又因久病多瘀，佐以川芎活血化瘀，血運通暢有利于濁毒之邪排出。正邪兼顧，補、泄融為一體，使補而不留邪，泄而不傷其正。此方不僅延緩了CKD的進展，而且對一系列并發(fā)的臨床癥狀有明顯的緩解和消除作用。

前期體外研究發(fā)現(xiàn)，三草尿毒靈能抑制Shh 引起的腎成纖維化細胞的增殖以及Shh 信號的傳導。本研究發(fā)現(xiàn)，在單側腎缺血再灌注模型中，UIRI 小鼠血肌酐和尿素氮水平明顯升高，在分別給予三草尿毒靈和Shh/Gli 信號通路抑制劑CPN 治療后，UIRI 小鼠的血肌酐和尿素氮水平明顯下降，起到了保護腎功能的作用。此外三草尿毒靈和CPN 還可減輕UIRI 小鼠的腎臟細胞外基質(zhì)的沉積，抑制腎臟纖維化進展。進一步研究發(fā)現(xiàn)，三草尿毒靈與CPN 一樣，都可阻斷Shh/Gli 信號通路等表達，從而改善腎臟纖維化。

總之，Shh/Gli 信號通路在促進腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關鍵作用，調(diào)控Shh/Gli 信號通路等表達是防止腎臟纖維化等的重要靶點。三草尿毒靈作為中藥復方，含有多種有效成分，在延緩慢性腎臟病進展方面具有獨特優(yōu)勢。前期研究表明本方具有減少ECM 形成、降低TGF-β1水平的作用。通過本次動物實驗研究，進一步證實三草尿毒靈能保護單側腎缺血再灌注小鼠的腎功能，并能阻斷Shh/Gli信號通路的表達，從而減輕腎臟纖維化，說明其抗腎纖維化的作用機制與調(diào)控Shh/Gli 信號的表達密切相關。