高分辨熔解曲線分析技術(shù)臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

李宗波

(天津市津南醫(yī)院，天津 300350)

高分辨熔解曲線分析技術(shù)(HRM)是在2002年由Utah大學(xué)Wittwer實(shí)驗(yàn)室和Idaho公司合作研發(fā)，它的原理是在PCR基礎(chǔ)上加入飽和熒光染料、監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線變化的新興核酸分析技術(shù)[1]。高分辨熔解曲線分析技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到臨床的各個(gè)領(lǐng)域，對(duì)遺傳病、腫瘤的診斷和細(xì)菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)、藥物的鑒定等發(fā)揮了重要作用。

1 高分辨熔解曲線分析技術(shù)概況

Utah大學(xué)的Wittwer實(shí)驗(yàn)室和Idaho公司在1997年首次提出PCR聯(lián)合熔解曲線，由熒光信號(hào)變化實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR產(chǎn)物的技術(shù)，隨后幾年此方法不斷改進(jìn)，經(jīng)歷了HR-1，LightScanner和Rotor-Gene 6000等，期間也不斷有其他公司研制出用于HRM分析的檢測儀器，比如ABI公司、Bio-Rad公司等[2]。他們的原理都是基于PCR和熔解曲線技術(shù)的結(jié)合，檢測的是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中飽和熒光染料的強(qiáng)度，通過熒光染料的強(qiáng)度變化繪制熔解曲線，熔解曲線的不同形態(tài)代表著單個(gè)堿基的差異，從而判斷堿基序列是否突變。此項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵是飽和熒光染料，飽和熒光染料也經(jīng)歷了一系列的更新?lián)Q代，由最初的SYBR Green Ⅰ到LC Green Plus，Syto9，EvaGreens等，不同染料對(duì)分析結(jié)果影響很大，有的染料不適用于雜合子變異檢測，有的不適用于光譜不匹配分析儀，因此檢測時(shí)應(yīng)選擇適用的飽和熒光染料。相較于其他分子診斷方法，HRM具有快速簡便、成本低、靈活性高、敏感性高、特異性高、閉管操作等優(yōu)點(diǎn)。

2 高分辨熔解曲線分析技術(shù)臨床應(yīng)用

2.1 遺傳病

遺傳病是指生殖細(xì)胞或受精卵的遺傳物質(zhì)(染色體和基因)發(fā)生突變(或畸變)所引起的疾病，包括單基因病、多基因病和染色體病三大類，染色體病又分為常染色體病和性染色體病，有學(xué)者研究表明可以通過HRM技術(shù)早期診斷遺傳病。帶-3蛋白(band-3)缺陷是遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥相關(guān)基因之一，是因紅細(xì)胞膜的帶-3蛋白缺陷導(dǎo)致紅細(xì)胞由雙凹圓盤形變成球形，易在被脾臟內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲吞噬引起的，SLC4A1基因突變可引起帶-3蛋白缺陷，何本進(jìn)等[3]研究表明高效、準(zhǔn)確、低成本的分子診斷方法HRM可以對(duì)SLC4A1基因進(jìn)行突變篩查，從而輔助診斷遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥。李閃等[4]研究發(fā)現(xiàn)軟骨發(fā)育不全與FGFR3基因Gly380Arg突變有關(guān)，軟骨發(fā)育不良與FGFR3基因Asn540Lys突變有關(guān)，并針對(duì)兩組基因突變建立了HRM技術(shù)的快速篩查方法。角膜炎-魚鱗病-耳聾綜合征的GJB2基因[5]、原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病的HPGD基因[6]、原發(fā)性局限性皮膚淀粉樣變的OSMR基因[7]等都可以采用HRM作為篩查方法。這些遺傳病尚無有效的治療手段，因此早期診斷有利于阻止缺陷兒童的出生，促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育工作。

2.2 腫瘤

腫瘤是人體器官組織的正常細(xì)胞在外來和內(nèi)在有害因素的長期作用下所產(chǎn)生的一種以細(xì)胞過度增殖為主要特征的新生物，可以分為良性和惡性兩大類，惡性腫瘤浸潤破壞器官的結(jié)構(gòu)和功能，因而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重影響，良性腫瘤若發(fā)生在重要器官也可產(chǎn)生嚴(yán)重后果，因此腫瘤患者的早期診斷和治療就顯得尤為重要。乳腺癌和子宮肌瘤是困擾女性的兩大疾病，且近年來發(fā)病率有年輕化趨勢(shì)，佘亞輝等[8]研究表明乳腺癌的發(fā)病率與BRCA1/2基因突變有關(guān)，葉軍等[9]證實(shí)了MED12基因突變與子宮肌瘤有關(guān)，這兩種基因突變都可以采用HRM技術(shù)進(jìn)行檢測，可用于高危人群的健康篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為廣大婦女同志帶來福音。HRM技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌治療效果[10]、結(jié)腸癌發(fā)現(xiàn)及預(yù)后[11]、腦膠質(zhì)瘤診斷和治療[12]、良性前列腺增生和前列腺癌[13]、骨髓增生異常綜合征、慢性淋巴細(xì)胞白血病[14]、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性骨髓纖維化[15]等各個(gè)方面得到廣泛使用，為腫瘤患者的篩查和早期診斷提供了可能，延緩了患者生命。

2.3 糖尿病

國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)計(jì)到2035年糖尿病患者達(dá)到5.92億[16]。有學(xué)者研究表明[17]飽和脂肪酸與糖耐量受損、高胰島素血癥和糖尿病危險(xiǎn)性有關(guān)，而不飽和脂肪酸對(duì)糖尿病具有保護(hù)作用。脂肪酸去飽和酶(FADS)是飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，對(duì)體內(nèi)脂肪酸代謝起關(guān)鍵作用。有研究表明[18]，在中年人群中△6-去飽和酶活性與糖尿病呈正相關(guān)，而△5-去飽和酶與糖尿病呈負(fù)相關(guān)，HRM小片段擴(kuò)增法可用于檢測去飽和酶在2型糖尿病患者中的基因分布，旨在為2型糖尿病預(yù)防診斷治療提供依據(jù)。

2.4 細(xì)菌和真菌及病毒的鑒定及藥敏

細(xì)菌感染性疾病的關(guān)鍵是病原菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法因耗時(shí)較長，無法滿足臨床要求。為滿足臨床需要，多位學(xué)者致力于使用HRM技術(shù)用于細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)。Navratilova等[19]建立的PCR-HRMA方法用于分枝桿菌菌種的鑒定，鑒別能力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的表型鑒定方法，并且鑒定速度要遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的鑒定方法，為結(jié)核病的快速診斷治療提供有力依據(jù)。隨著抗結(jié)核藥物的不合理使用，耐藥結(jié)核分枝桿菌越來越多，堿基的突變位置與抗結(jié)核藥物類型有相關(guān)性，有學(xué)者研究表明[20]，異煙肼耐藥的結(jié)核分枝桿菌有KatG和inhA基因突變，為臨床合理用藥提供了可靠依據(jù)。此后還有多種細(xì)菌采用高分辨熔解曲線分析技術(shù)得到了快速鑒定和抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌的鑒別[21]、5種大腸埃希菌血清型的鑒別[22]、淋病奈瑟菌的鑒定及耐藥試驗(yàn)[23]等等。

外陰陰道念珠菌病(VVC)是育齡期婦女的常見病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，并且病情極易反復(fù)，給臨床診斷治療帶來很大困難，給患者造成極大痛苦。葛瑋等[24]認(rèn)為HRM技術(shù)可以用于陰道念珠菌的分型研究，此方法可以將致病性念珠菌鑒定到種，它比傳統(tǒng)的鑒定方法操作簡便、快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，并且實(shí)現(xiàn)閉管操作避免污染。

依據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，感染乙肝病毒的人數(shù)大約有20 億以上，慢性乙肝約有3.6 億[25]。我國是肝炎大國，慢性乙肝發(fā)病率高，并可逐漸進(jìn)展成肝硬化、肝癌，不同的疾病進(jìn)程藥物治療的差異很大[26]。楊旭潔等[27]應(yīng)用HRM技術(shù)檢測慢性乙肝、乙肝肝硬化和乙肝肝癌患者血液中的CYP3A5等位基因GG，AG和AA以及MDR1 C3435T等位基因CT，CC，研究表明[27]CYP3A5等位A基因與肝硬化和肝癌有正相關(guān)性，MDR1 C3435T基因多態(tài)性與患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)、疾病的易感性和臨床表現(xiàn)有關(guān)，為疾病的鑒別診斷和治療提供了理論依據(jù)。

2.5 藥物

種子類和谷物芽類藥材是中藥材重要的組成部分，因體積小、形態(tài)相近，肉眼難以分辨，極易混淆，另外為了謀取利益，一些不法商家故意在藥材中摻假，導(dǎo)致有些患者療效不佳，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，給患者及家屬帶來痛苦。為了解決這些問題，Osathanunkul等[28]利用HRM技術(shù)檢測種子類和谷物類藥材的DNA，與中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫比較來鑒別藥材的真假，為臨床安全準(zhǔn)確用藥提供了依據(jù)。人參和西洋參屬于名貴藥材，價(jià)格昂貴，市場上仿冒的特別多，作為普通的消費(fèi)者很難區(qū)分其真?zhèn)?，有學(xué)者[29]將HRM技術(shù)應(yīng)用于人參和西洋參的鑒定，與中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所研究員的鑒定結(jié)果一致，收到了很好的效果。陳康等[30]在鑒定鹿茸分子及Sahachat[31]和Aliki等[32]在中草藥鑒定中也都應(yīng)用過此方法，說明HRM技術(shù)在中藥真?zhèn)舞b定中是一種可信的鑒定方法。

3 展 望

高分辨熔解曲線分析技術(shù)具有操作簡便、高通量、快速、低成本、全程閉管操作無污染等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳病和腫瘤的早期診斷、細(xì)菌真菌的分型鑒定、藥敏和藥物鑒定方面有很好的應(yīng)用價(jià)值。但是也有其自身的局限性，比如不能用于RNA的檢測、堿基變異鑒別能力較弱、只能檢測小片段擴(kuò)增產(chǎn)物、無法區(qū)分熔解曲線相似的變異等，但隨著各個(gè)方面的改進(jìn)及多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，高分辨熔解曲線分析技術(shù)一定會(huì)成為精準(zhǔn)高效的應(yīng)用平臺(tái)。